Aplicación de técnicas de fluorescencia y microscopía de fuerza atómica al estudio de la interacción lípido-proteína en modelos de membrana
Las proteínas de membrana constituyen entre un 25 y un 30 % de las proteínas presentes en las células, pudiendo estar implicadas, en algunos casos, en mecanismos de resistencia a determinados fármacos. Es por ello de gran interés el estudio de estas proteínas en modelos biomiméticos.<br/><b...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2005 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/1805 |
| Acceso en línea: | http://www.tdx.cat/TDX-0613105-124641 http://hdl.handle.net/10803/1805 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Proteïnes de membrana Models biomimètics Resistència als fàrmacs Ciències de la Salut 615 |
| Sumario: | Las proteínas de membrana constituyen entre un 25 y un 30 % de las proteínas presentes en las células, pudiendo estar implicadas, en algunos casos, en mecanismos de resistencia a determinados fármacos. Es por ello de gran interés el estudio de estas proteínas en modelos biomiméticos.<br/><br/>El conocimiento existente sobre los fenómenos implicados en el proceso de reconstitución de proteínas transmembranarias en liposomas es limitado. Dicho proceso es fundamentalmente empírico, e implica la utilización de liposomas y surfactantes, así como proteínas con un alto grado de pureza. Estas condiciones son un requisito imprescindible para poder realizar estudios de integración de las proteínas, de su disposición en la bicapa y de su función biológica.<br/><br/>La aplicación de técnicas nanométricas, como la microscopía de fuerza atómica (AFM), así como determinados métodos de fluorescencia (cálculo del incremento de potencial electrostático de superficie y anisotropía de la fluorescencia), permiten el estudio del proceso de reconstitución de proteínas.<br/><br/>La aplicación de la AFM al estudio de láminas lípido-proteicas y cristales bidimensionales permite el estudio estructural de proteínas de membrana, así como la posibilidad de estudiar en tiempo real y en condiciones biomiméticas este tipo de moléculas, permitiendo, en algunos casos, el diseño de biosensores.<br/><br/>La hipótesis de trabajo y objetivo principal de esta Tesis fue el estudio detallado del proceso de reconstitución de dos proteínas transmembranarias, la porina Omp1 de <i>Serratia marcescens</i> y la lactosa permeasa de <i>Escherichia coli</i> (LacY), tomando como modelo para comprobar la posible aplicación de las técnicas utilizadas a este tipo de moléculas, el citocromo c (Cyt c) y la melitina (MLT).<br/><br/>Las principales conclusiones a las que se llegó en este trabajo fueron:<br/><br/>· Las proteínas Omp1 y LacY presentaron una estructura y estabilidad en solución condicionadas por la presencia de surfactante adecuado.<br/>· La solubilización de liposomas con los surfactantes OG y DDM fue estudiada con las composiciones lipídicas: POPC, DMPC:POPC (1:1, mol:mol), POPE:POPG (3:1, mol:mol) y extracto lipídico de <i>E. coli</i>, en las que incorporaron las proteínas de membrana, permitiendo obtener tanto proteoliposomas como láminas lípido-proteicas.<br/>· La incorporación de Cyt c, MLT, Omp1 y LacY a la bicapa lipídica produce, en los casos estudiados, variaciones positivas del valor del potencial electrostático de superficie.<br/>· Los valores de "delta-phi" demuestran que la incorporación de las proteínas estudiadas se produce tanto por interacción electrostática, como por su balance hidrofília/lipofília.<br/>· Se observa una rigidificación de la bicapa lipídica al incorporar la LacY, debida a la reorganización de los lípidos, para conferir estabilidad a la proteína.<br/>· La incorporación de la LacY puede inducir la segregación lateral de fosfolípidos, al formarse regiones enriquecidas en las mismas.<br/>· La proteína LacY, en forma de dímero, fue cristalizada en 2D, obteniéndose los parámetros de celda: a = 13,15 nm, b = 16,74 nm, gamma = 116º.<br/>· La incorporación óptima de proteínas de membrana para dar lugar a cristales 2D, se produce en fosfolípidos como la POPC, que se encuentran en estado fluido durante todo el proceso de cristalización y que no presentan dominios lipídicos.<br/>· La inmovilización de proteínas sobre sustratos adecuados es un factor crítico en el control y manipulación molecular necesarios para posibles aplicaciones, como podría ser el diseño y fabricación de biosensores. |
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