Development of elastin-like recombinamers with increasing complexity and functionality from the molecular to the macroscopic scale

La compleja maquinaria empleada por la Naturaleza para el diseño y la fabricación de estructuras supramoleculares basadas en proteínas no ha hecho más que alentar los esfuerzos de investigadores para lograr su imitación. Su singularidad morfológica y bioquímica dicta no solo las funciones estructura...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: González Pérez, Miguel
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2021
País:España
Institución:Universidad de Valladolid
Repositorio:UVaDOC. Repositorio Documental de la Universidad de Valladolid
OAI Identifier:oai:uvadoc.uva.es:10324/52005
Acceso en línea:https://doi.org/10.35376/10324/52005
https://uvadoc.uva.es/handle/10324/52005
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Proteínas
Polipéptidos
Biotecnología
24 Ciencias de la Vida
33 Ciencias Tecnológicas
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Universidad de Valladolid. Escuela de Ingenierías Industriales
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description La compleja maquinaria empleada por la Naturaleza para el diseño y la fabricación de estructuras supramoleculares basadas en proteínas no ha hecho más que alentar los esfuerzos de investigadores para lograr su imitación. Su singularidad morfológica y bioquímica dicta no solo las funciones estructurales sino también las biológicas de toda clase de organismos vivos. El avance en el conocimiento sobre su expresión génica supuso un hito en su replicación, estudio y diseño para un amplio número de aplicaciones. Recientemente, proteínas “bioinspiradas” han sido genéticamente diseñadas y fabricadas por tecnologías de ADN recombinante, siendo los recombinámeros de tipo elastina (ELRs) una clase prometedora de estos biomateriales en sí mismos. Esta familia de polipéptidos, que consiste en la repetición de la secuencia L-Val-L-Pro-Gly-X-Gly, está diseñada para recapitular las regiones hidrofóbicas e intrínsecamente desordenadas de la tropoelastina. De esta manera, su estructura polipeptídica conserva la temperatura de transición (Tt) o temperatura crítica inferior de solución (conocida como “lower critical solution temperature” o “LCST”), la biocompatibilidad intrínseca y el comportamiento elástico de la elastina. Su origen recombinante junto con su naturaleza modulable facilita la inclusión de biofuncionalidades extrínsecas, tales como la biodegradabilidad, la angiogénesis, la adhesividad celular y la actividad antimicrobiana entre otras. Esta característica puede ser explotada aún más ajustando su respuesta intrínseca de autoensamblaje. En este sentido, dominios física y covalentemente entrecruzables junto con configuraciones modulares en bloque pueden desviar el proceso de separación de fases guiando la formación de una amplia gama de estructuras supramoleculares. El Capítulo 4 examina la afinidad a nivel molecular de dos ELRs, el V84 con carácter hidrofóbico y el EI con carácter anfifílico, frente a superficies decoradas con los grupos CH3, OH, COOH y NH2. El cloruro de tetraquis (hidroximetil) fosfonio (THPC) fue unido adicionalmente a ambos polipéptidos y se evaluó su efecto sobre la afinidad de adhesión. Las técnicas de microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de la disipación (QCM-D), resonancia de plasmón superficial multiparamétrica (MP-SPR) y microscopía de fuerza atómica (AFM) revelaron la diferente adsorción y conformación mostrada por los recubrimientos de ELR. Mientras que el V84 mostró una fuerte adhesión formando redes hidratadas y extendidas, el EI dirigió la formación de recubrimientos más rígidos. El grosor de las capas depositadas permitió identificar la afinidad preferencial de ambos ELR modificados con THPC por los restos alifáticos (CH3) y los sustratos terminados en NH2 cargados positivamente. El Capítulo 5 se centra en la fabricación, en una interfaz líquida, de membranas micrométricas a base de recombinámeros de tipo elastina de espesor y propiedades de difusión controladas. Dos ELR modificados con grupos reactivos tipo “click”, el SKS-azida y el VKV-ciclooctino, fueron diseñados para ser disueltos a temperatura ambiente en una fase acuosa o una fase orgánica inmiscible con el agua, respectivamente. Para evitar la transición de fase del ELR SKS aminoácidos de tipo serina fueron intercalados uniformemente a lo largo de la cadena principal del polipéptido. El carácter polar de los grupos hidroxilo confirió una temperatura de transición (Tt) elevada al SKS asegurando su estado hidrofóbicamente solvatado durante la reacción de entrecruzamiento “click” y la formación de la membrana de ELR en la interfaz líquida. De manera complementaria, el tripéptido RGD fue codificado genéticamente en el ELR SKS para confirmar la capacidad de la tecnología desarrollada para fabricar membranas con bioactividad personalizada. El aumento de la concentración de los recombinámeros empleados resultó en un incremento del espesor de la membrana y en una disminución de los coeficientes efectivos de difusión (DEff). Este parámetro fue evaluado empleando celdas de Franz y moléculas de dextrano marcadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) de pesos moleculares entre 4 y 150 kDa. La observación en tiempo real de la formación de la membrana en la interfaz líquida permitió estudiar el proceso de entrecruzamiento, mientras que la microscopía electrónica de barrido ambiental (ESEM) ofreció una visión microscópica de las membranas de tipo elastina en su estado hidratado. El último Capítulo 6 está dedicado al desarrollo de un modelo bicapa macroscópico de la túnica adventicia y lámina elástica externa de la pared vascular. En este sentido, se seleccionó una pareja de ELRs, el RGD y el GTAR, para reproducir la lámina elástica externa, mientras que fibroblastos dérmicos humanos neonatales (HDFn) fueron embebidos en colágeno de tipo I para la replicación de la túnica adventicia. Específicamente, para enriquecer la respuesta bioactiva de la capa a base de ELR, dominios de adhesión celular fueron intercalados en el ELR RGD mientras que secuencias biodegradables fueron codificadas en el esqueleto del ELR GTAR. Además, los grupos entrecruzables de tipo click azida y ciclooctino se anclaron, respectivamente, a cada uno de los ELRs reforzando así la estabilidad de la capa en el constructo. Un molde cilíndrico, conteniendo un tubo de soporte en el centro, fue empleado para la fabricación del modelo bicapa. Esta técnica de bioconstrucción permitió ajustar la composición de las capas fabricando así un modelo conteniendo un 30% en peso de ELR en la capa de colágeno que reproducía la presencia de elastina en la túnica adventicia. La maduración del constructo in vitro identificó la capacidad del ELR y colágeno para proporcionar un entorno favorable para la viabilidad de los HDFn, mientras que la evaluación por histoquímica reveló la remodelación de ambas capas y la expresión de una matriz extracelular rica en glicosaminoglicanos indicando la diferenciación de los fibroblastos en miofibroblastos con el tiempo. Los dominios de adhesión celular introducidos en el modelo demostraron promover la aproximación de las células embebidas hacia la capa de ELR interna, mientras que el estado de transicionado del ELR dio como resultado la formación de morfologías onduladas a la par que confirieron un predominante carácter elástico de la capa de ELR en comparación con la de colágeno. En resumen, los trabajos desarrollados en esta tesis proporcionan nuevos conocimientos sobre el diseño y la fabricación de estructuras novedosas con una creciente complejidad y funcionalidad a partir de ELRs. Específicamente, el trabajo desarrollado describe el papel de la estructuración en bloques y las interacciones no covalentes sobre el ensamblaje de las cadenas de tipo elastina frente a superficies funcionalizadas, destaca el hallazgo de una interfaz líquida para la fabricación de membranas micrométricas de tipo elastina con propiedades de difusión ajustables y el desarrollo de un modelo macroscópico bicapa con bioactividad personalizada que replica la túnica adventicia y lámina elástica externa en combinación con HDFn y colágeno de tipo I.
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Esta familia de polipéptidos, que consiste en la repetición de la secuencia L-Val-L-Pro-Gly-X-Gly, está diseñada para recapitular las regiones hidrofóbicas e intrínsecamente desordenadas de la tropoelastina. De esta manera, su estructura polipeptídica conserva la temperatura de transición (Tt) o temperatura crítica inferior de solución (conocida como “lower critical solution temperature” o “LCST”), la biocompatibilidad intrínseca y el comportamiento elástico de la elastina. Su origen recombinante junto con su naturaleza modulable facilita la inclusión de biofuncionalidades extrínsecas, tales como la biodegradabilidad, la angiogénesis, la adhesividad celular y la actividad antimicrobiana entre otras. Esta característica puede ser explotada aún más ajustando su respuesta intrínseca de autoensamblaje. En este sentido, dominios física y covalentemente entrecruzables junto con configuraciones modulares en bloque pueden desviar el proceso de separación de fases guiando la formación de una amplia gama de estructuras supramoleculares. El Capítulo 4 examina la afinidad a nivel molecular de dos ELRs, el V84 con carácter hidrofóbico y el EI con carácter anfifílico, frente a superficies decoradas con los grupos CH3, OH, COOH y NH2. El cloruro de tetraquis (hidroximetil) fosfonio (THPC) fue unido adicionalmente a ambos polipéptidos y se evaluó su efecto sobre la afinidad de adhesión. Las técnicas de microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de la disipación (QCM-D), resonancia de plasmón superficial multiparamétrica (MP-SPR) y microscopía de fuerza atómica (AFM) revelaron la diferente adsorción y conformación mostrada por los recubrimientos de ELR. Mientras que el V84 mostró una fuerte adhesión formando redes hidratadas y extendidas, el EI dirigió la formación de recubrimientos más rígidos. El grosor de las capas depositadas permitió identificar la afinidad preferencial de ambos ELR modificados con THPC por los restos alifáticos (CH3) y los sustratos terminados en NH2 cargados positivamente. El Capítulo 5 se centra en la fabricación, en una interfaz líquida, de membranas micrométricas a base de recombinámeros de tipo elastina de espesor y propiedades de difusión controladas. Dos ELR modificados con grupos reactivos tipo “click”, el SKS-azida y el VKV-ciclooctino, fueron diseñados para ser disueltos a temperatura ambiente en una fase acuosa o una fase orgánica inmiscible con el agua, respectivamente. Para evitar la transición de fase del ELR SKS aminoácidos de tipo serina fueron intercalados uniformemente a lo largo de la cadena principal del polipéptido. El carácter polar de los grupos hidroxilo confirió una temperatura de transición (Tt) elevada al SKS asegurando su estado hidrofóbicamente solvatado durante la reacción de entrecruzamiento “click” y la formación de la membrana de ELR en la interfaz líquida. De manera complementaria, el tripéptido RGD fue codificado genéticamente en el ELR SKS para confirmar la capacidad de la tecnología desarrollada para fabricar membranas con bioactividad personalizada. El aumento de la concentración de los recombinámeros empleados resultó en un incremento del espesor de la membrana y en una disminución de los coeficientes efectivos de difusión (DEff). Este parámetro fue evaluado empleando celdas de Franz y moléculas de dextrano marcadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) de pesos moleculares entre 4 y 150 kDa. La observación en tiempo real de la formación de la membrana en la interfaz líquida permitió estudiar el proceso de entrecruzamiento, mientras que la microscopía electrónica de barrido ambiental (ESEM) ofreció una visión microscópica de las membranas de tipo elastina en su estado hidratado. El último Capítulo 6 está dedicado al desarrollo de un modelo bicapa macroscópico de la túnica adventicia y lámina elástica externa de la pared vascular. En este sentido, se seleccionó una pareja de ELRs, el RGD y el GTAR, para reproducir la lámina elástica externa, mientras que fibroblastos dérmicos humanos neonatales (HDFn) fueron embebidos en colágeno de tipo I para la replicación de la túnica adventicia. Específicamente, para enriquecer la respuesta bioactiva de la capa a base de ELR, dominios de adhesión celular fueron intercalados en el ELR RGD mientras que secuencias biodegradables fueron codificadas en el esqueleto del ELR GTAR. Además, los grupos entrecruzables de tipo click azida y ciclooctino se anclaron, respectivamente, a cada uno de los ELRs reforzando así la estabilidad de la capa en el constructo. Un molde cilíndrico, conteniendo un tubo de soporte en el centro, fue empleado para la fabricación del modelo bicapa. Esta técnica de bioconstrucción permitió ajustar la composición de las capas fabricando así un modelo conteniendo un 30% en peso de ELR en la capa de colágeno que reproducía la presencia de elastina en la túnica adventicia. La maduración del constructo in vitro identificó la capacidad del ELR y colágeno para proporcionar un entorno favorable para la viabilidad de los HDFn, mientras que la evaluación por histoquímica reveló la remodelación de ambas capas y la expresión de una matriz extracelular rica en glicosaminoglicanos indicando la diferenciación de los fibroblastos en miofibroblastos con el tiempo. Los dominios de adhesión celular introducidos en el modelo demostraron promover la aproximación de las células embebidas hacia la capa de ELR interna, mientras que el estado de transicionado del ELR dio como resultado la formación de morfologías onduladas a la par que confirieron un predominante carácter elástico de la capa de ELR en comparación con la de colágeno. En resumen, los trabajos desarrollados en esta tesis proporcionan nuevos conocimientos sobre el diseño y la fabricación de estructuras novedosas con una creciente complejidad y funcionalidad a partir de ELRs. Específicamente, el trabajo desarrollado describe el papel de la estructuración en bloques y las interacciones no covalentes sobre el ensamblaje de las cadenas de tipo elastina frente a superficies funcionalizadas, destaca el hallazgo de una interfaz líquida para la fabricación de membranas micrométricas de tipo elastina con propiedades de difusión ajustables y el desarrollo de un modelo macroscópico bicapa con bioactividad personalizada que replica la túnica adventicia y lámina elástica externa en combinación con HDFn y colágeno de tipo I.Departamento de Física de la Materia Condensada, Cristalografía y MineralogíaDoctorado en FísicaRodríguez Cabello, José CarlosUniversidad de Valladolid. Escuela de Ingenierías Industriales2021info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttps://doi.org/10.35376/10324/52005https://uvadoc.uva.es/handle/10324/52005reponame:UVaDOC. 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