Análisis transcriptómicos para el estudio de los mecanismos genéticos que controlan la deposición grasa en corderos lechales

170 p.

Detalles Bibliográficos
Autor: Alonso García, María
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2025
País:España
Institución:Universidad de León
Repositorio:BULERIA. Repositorio Institucional de la Universidad de León
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Acceso en línea:https://hdl.handle.net/10612/28010
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Producción animal
Tejido adiposo
RNA-Seq
Adipogenesis
Efecto intergeneracional
Cordero lechal
Expresión génica
Suckling lamb
Gene expression
Intergenerational effect
Adipose tissue
3104 Producción Animal
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spelling Análisis transcriptómicos para el estudio de los mecanismos genéticos que controlan la deposición grasa en corderos lechalesTranscriptomic analyses for the study of genetic mechanisms controlling fat deposition in suckling lambsAlonso García, MaríaProducción animalTejido adiposoRNA-SeqAdipogenesisEfecto intergeneracionalCordero lechalExpresión génicaSuckling lambGene expressionIntergenerational effectAdipose tissue3104 Producción Animal170 p.[ES] La presente Tesis Doctoral se propone con el objetivo general de caracterizar los mecanismos genéticos y moleculares que regulan el proceso de la deposición grasa en corderos lechales mediante análisis transcriptómicos, evaluando tanto la influencia de factores intrínsecos, como los posibles efectos intergeneracionales de una restricción nutricional. Para ello, se definieron tres objetivos específicos: (I) la identificación de genes y transcritos reguladores tipo transcritos largos no codificantes (lncRNAs, del inglés long non-coding RNA) diferencialmente expresados en el tejido adiposo perirrenal entre corderos lechales con diferentes niveles de deposición grasa explorando su posible función reguladora; (II) la evaluación del efecto intergeneracional de una restricción proteica en la dieta sufrida por corderas de reposición en la etapa prepuberal sobre el perfil transcriptómico del tejido graso perirrenal de sus corderos lechales; y (III) la comparación del perfil transcriptómico de la grasa perirrenal y la grasa de la cola de corderos lechales, evaluando las diferencias moleculares y del microambiente celular entre ambos tejidos. En relación con el primer objetivo, se compararon los transcriptomas de la grasa perirrenal de dos grupos de corderos lechales de raza Assaf sacrificados a un peso vivo fijo (~ 11 kg), con edades comprendidas entre 17 y 36 días y que presentaban diferencias significativas en el porcentaje de grasa perirrenal en la canal (KKCF, del inglés Kidney Knob and Channel Fat). Según este porcentaje, los animales se clasificaron como Alto-KKCF (n = 4) y BajoKKCF (n = 4). Para ello, se llevó a cabo un análisis de expresión diferencial (DEA) con el software DESeq2 e incorporando la edad al sacrificio como variable categórica en el modelo. Este análisis identificó un total de 80 genes diferencialmente expresados (DEGs) entre ambos grupos. El análisis de enriquecimiento funcional para los DEGs con mayor expresión en el grupo Bajo-KKCF (49) destacó términos vinculados a la biosíntesis de lípidos y la termogénesis, mientras que los DEGs relacionados con el grupo Alto-KKCF (31) se relacionaron con el proceso de vasculogénesis. Estos resultados sugieren que los depósitos de grasa de los animales con mayor nivel de engrasamiento perirrenal se encuentran en una etapa de desarrollo más avanzada que el de los corderos con menor nivel de deposición grasa. Además, en los 80 DEGs detectados, se realizó un estudio de identificación de variantes y se detectaron 331, siendo la mayoría (~90%) polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs, del inglés Single Nucleotide Polimorphism). Algunas de estas variantes se asociaron de manera específica a los DEGs con mayor expresión en uno de los grupos considerados, Alto-KKCF (101) o al Bajo-KKCF (171). El análisis con el paquete de R GALLO para esas variantes específicas de grupo detectó un enriquecimiento significativo de QTLs (del inglés, Quantitative Trait Locus) para caracteres de calidad de la canal y la carne, aportando una lista preliminar de variantes candidatas para caracteres de engrasamiento en ganado ovino. Por otra parte, con el fin de identificar transcritos lncRNA relacionados con los niveles de engrasamiento en corderos lechales, se realizó un meta-análisis utilizando dos conjuntos de datos de RNA-Seq de grasa perirrenal de corderos lechales: el primero, generado en un estudio anterior en el que se habían comparado dos razas que difieren en caracteres de deposición grasa en la canal, Churra (n= 6) y Assaf (n = 8), y el segundo, incluyendo las muestras analizadas previamente para comparar corderos lechales Assaf con niveles divergentes de deposición de grasa (n = 8). El análisis conjunto de las 22 muestras de RNAseq de grasa perirrenal con el software FEELnc permitió la detección de 3.953 lncRNAs nuevos. Tras realizar el meta-análisis, se identificaron 251 DEGs entre animales de alta y baja deposición grasa a nivel perirrenal, 21 de los cuales eran lncRNAs que no estaban previamente anotados en el genoma de referencia. Además, un análisis de co-expresión mostró que los lncRNAs pueden desempeñar un papel regulador de la angiogénesis y la termogénesis, procesos asociados con un alto y bajo nivel de deposición grasa en el cordero lechal, respectivamente. En cuanto al segundo objetivo específico de la Tesis, las muestras de RNA-Seq de grasa perirrenal de los ocho corderos Assaf anteriormente mencionados (Grupo Control) se compararon con las obtenidas en otros ocho corderos nacidos de corderas de reposición que habían sufrido una restricción proteica en la dieta durante su desarrollo prepuberal (Grupo MNPR, del inglés Maternal Nutritional Protein Restriction). Dentro de cada uno de estos grupos, se realizó un DEA entre corderos con alto y bajo nivel de engrasamiento perirrenal. Posteriormente los resultados de los dos DEAs se combinaron en un metaanálisis, lo que permitió identificar genes asociados con los niveles de acumulación de grasa (Core-DEGs) y, también, genes con expresión alterada por el efecto intergeneracional de la restricción nutricional sufrida por las madres (MNPR-responsive DEGs). El enriquecimiento funcional de los 316 Core-DEGs identificados confirmó y aportó más información a lo observado en los estudios incluidos en el primer objetivo de esta tesis. Así, un alto nivel de deposición grasa estaba asociado a un punto tardío de la diferenciación adipocitaria caracterizado por un incremento de la actividad vasculogénica; mientras, los animales con menor nivel de deposición grasa presentaban una fuerte activación de la adipogénesis propia de un punto más temprano de la diferenciación celular. Por otro lado, el análisis de enriquecimiento de los 311 MNPR-responsive DEGs indicó que, independientemente del punto de maduración en el que se encontrara el tejido adiposo perirrenal del animal, el patrón de expresión de los genes implicados en el desarrollo del tejido adiposo perirrenal indicaba la activación de la adipogénesis, lo que podría aumentar el futuro potencial de acumulación lipídica de ese tejido y, con ello, la capacidad para acumular grasa de la descendencia. Este estudio ofrece, por primera vez, evidencias transcriptómicas que demuestran el impacto intergeneracional de una restricción proteica nutricional en ovejas durante la edad prepuberal sobre el proceso de adipogénesis posnatal temprana en su descendencia. Estos hallazgos concuerdan con los descritos en otras especies y pueden ser de interés a la hora de valorar ciertas estrategias de manejo en ganado ovino y podrían tener implicaciones para la comprensión de los mecanismos subyacentes a este tipo de efectos intergeneracionales en otras especies, incluido el ser humano. Finalmente, para abordar el tercer objetivo de la presente Tesis Doctoral se utilizó la información transcriptómica de la grasa perirrenal y de la grasa de la cola de ocho corderos lechales de raza Assaf, para comparar los dos tejidos a nivel de expresión génica, microambiente celular y a nivel de procesamiento (splicing) alternativo del RNA. En primer lugar, se realizó un DEA con DESeq2, incluyendo el propio individuo como factor en el modelo. Los 6.000 DEGs identificados reflejaron que, a la edad del sacrificio, el tejido perirrenal de los corderos lechales presenta una cascada de regulación adipogénica activada, mientras que el tejido de la cola muestra un perfil metabólico más maduro, con enriquecimiento en rutas de biosíntesis lipídica. Posteriormente, usando como referencia datos secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-Seq) de tejido adiposo de vaca, se realizó un análisis de deconvolución que confirmó la existencia de una mayor proporción de adipocitos maduros en la grasa de la cola. Por otro lado, la grasa perirrenal parecía menos diferenciada, con una mayor abundancia de preadipocitos, células mesoteliales, inmunes, pericíticas y musculares lisas, lo que indica un proceso de expansión y remodelación tisular en curso. Estos hallazgos revelan una divergencia funcional temprana entre los depósitos adiposos y demuestran la utilidad de los análisis de deconvolución entre especies para estudiar la especialización del tejido adiposo en especies ganaderas. Por último, el análisis de splicing alternativo realizado con el paquete de R IsoformSwitchAnalyzeR detectó 99.433 isoformas en los dos tejidos adiposos analizados. Para las 540 isoformas que mostraban un patrón de expresión diferente entre los dos tejidos, la caracterización funcional reveló una compleja regulación específica de cada depósito, incluyendo isoformas de genes clave en adipogénesis, termogénesis y señalización celular. Estos resultados confirman que la identidad funcional de los distintos depósitos grasos se establece en etapas muy tempranas del desarrollo. Además de la consecución de los objetivos específicos propuestos en la presente Tesis Doctoral, se desarrolló visualizeGO, un paquete de R que posibilita la reducción de la redundancia entre términos de ontología génica (GO, del inglés Gene Ontology), con el fin de mejorar la interpretación funcional de los resultados obtenidos en diferentes estudios genómicos. Considerando las 4 funciones principales ofrecidas por este paquete (clusterGO, compareGO, familyGO y visualizeGO), la comparación del rendimiento y los resultados del análisis de visualizeGO con otro paquete de R de uso común para este tipo de análisis evidenció que el nuevo paquete desarrollado ofrece una cierta mejora en capacidad de reducción de la redundancia, sin alterar el significado biológico de los resultados. Además, visualizeGO ofrece diversas opciones de comparación entre sets de datos y visualización jerárquica de los resultados que permiten una mejor interpretación de los mismos. En conjunto, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral proporcionan información transcriptómica sólida sobre los procesos genéticos determinantes o moduladores del desarrollo del tejido adiposo en la especie ovina y constituyen un punto de partida para la identificación de genes candidatos funcionales para caracteres de engrasamiento en esta especie. Este conocimiento representa un avance significativo en la comprensión de los mecanismos genéticos y moleculares asociados a los caracteres de calidad de la canal en el cordero lechal. Los resultados evidencian la relevancia del estado de maduración del tejido adiposo en el grado de engrasamiento de la canal y proporcionan biomarcadores potenciales indicativos de los distintos estadios de desarrollo en el cordero lechal. Además, el desarrollo metodológico ofrecido en esta Tesis Doctoral demuestra el valor de la integración de diferentes enfoques transcriptómicos para el estudio de caracteres biológicos complejos de interés económico en especies ganaderas.[EN] The general objective of this Doctoral Thesis is to characterise the genetic and molecular mechanisms that regulate the process of fat deposition in suckling lambs through transcriptomic analyses, evaluating both the influence of intrinsic factors and the possible intergenerational ejects of a nutritional restriction. To this end, three specific objectives were defined: (I) the identification of dijerentially expressed genes and regulatory transcripts such as long non-coding RNAs (lncRNAs) in perirenal adipose tissue between suckling lambs with dijerent levels of fat deposition, exploring their possible regulatory function; (II) the evaluation of the intergenerational eject of a dietary protein restriction sujered by replacement ewes at the prepubertal stage on the transcriptomic profile of the perirenal fat tissue of their suckling lambs; and (III) the comparison of the transcriptomic profiles between perirenal fat and tail fat in suckling lambs, to evaluate the molecular and cellular microenvironment dijerences between both tissues. In relation to the first objective, we compared the perirenal fat transcriptomes of two groups of Assaf suckling lambs slaughtered at a fixed live weight (~ 11 kg), aged between 17 and 36 days and with significant dijerences in the percentage of Kidney Knob and Channel Fat (KKCF). Based on this percentage, the animals were classified as High-KKCF (n = 4) and Low-KKCF (n = 4). To this end, a dijerential expression analysis (DEA) was performed, using the DESeq2 software and incorporating the age at slaughter as a categorical variable in the model. This analysis identified a total of 80 dijerentially expressed genes (DEGs) between the two groups. Functional enrichment analysis for the most highly expressed DEGs in the Low-KKCF group (49) highlighted terms linked to lipid biosynthesis and thermogenesis, while the DEGs related to the High-KKCF group (31) were related to the process of vasculogenesis. These results suggest that the fat deposits of animals with higher levels of perirenal fat are at a more advanced stage of development than those of lambs with lower levels of fat deposition. In addition, a variant detection analysis was performed on the 80 DEGs detected, and 331 variants were detected, most of which (~90%) were single nucleotide polymorphisms or SNPs. Some of these variants were specifically associated with the DEGs showing the higher expression in one of the groups considered, High-KKCF (101) or Low-KKCF (171). Analysis with the R GALLO package for these group-specific variants detected a significant enrichment of Quantitative Trait Loci (QTLs) for carcass quality and meat quality traits, providing a preliminary list of candidate variants for fattening traits in sheep. On the other hand, in order to identify lncRNAs related to fat deposition levels in suckling lambs, a meta-analysis was performed using two RNA-Seq datasets of perirenal fat from suckling lambs: the first dataset was generated in a previous study comparing two breeds that dijer in carcass fat deposition traits, Churra (n = 6) and Assaf (n = 8); and the second dataset included the samples previously analysed to compare Assaf suckling lambs with divergent levels of fat deposition (n = 8). The joint analysis of the 22 RNA-seq samples of perirenal fat using the FEELnc software allowed the detection of 3,953 new lncRNAs. After performing the meta-analysis, 251 DEGs were identified between animals with high and low fat deposition at the perirenal level, 21 of which were lncRNAs that were not previously annotated in the reference genome. Furthermore, a co-expression analysis showed that lncRNAs may play a regulatory role in angiogenesis and thermogenesis, processes associated with high and low-fat deposition levels in suckling lambs, respectively. Regarding the second specific objective of the Thesis, RNA-Seq samples of perirenal fat from the eight Assaf lambs mentioned above (Control Group) were compared with those obtained from eight additional lambs born from replacement ewes that had undergone a dietary protein restriction during their prepubertal development (MNPR Group, from Maternal Nutritional Protein Restriction). Within each of these groups, a DEA was performed between lambs with high and low levels of perirenal fat. The results of the two DEAs were then combined in a meta-analysis, which allowed the identification of genes associated with fat accumulation levels (Core-DEGs) and genes with altered expression due to the intergenerational eject of the nutritional restriction sujered by their mothers (MNPR-responsive DEGs). The functional enrichment of the 316 Core-DEGs confirmed and provided further information on the findings from the studies included in the first objective of this Thesis. Thus, a high level of fat deposition was associated with a late point of adipocyte dijerentiation characterised by increased vasculogenic activity, while animals with lower levels of fat deposition showed strong activation of adipogenesis typical of an earlier point of cell dijerentiation. On the other hand, the enrichment analysis of the 311 MNPR-responsive DEGs indicated that, regardless of the stage of maturation of the animal's perirenal adipose tissue, the gene expression pattern indicated the activation of adipogenesis, which could enhance the future potential for lipid accumulation in that tissue and, thus, the ability of ojspring to accumulate fat. This study provides, for the first time, transcriptomic evidence demonstrating the intergenerational impact of a nutritional protein restriction in prepubertal ewes on the process of early postnatal adipogenesis in their ojspring. These findings are consistent with those described in other species and may be of interest when evaluating certain management strategies in sheep. They could also have implications for understanding the mechanisms underlying this type of intergenerational eject in other species, including humans. Finally, to address the third objective of this doctoral thesis, transcriptomic information from the perirenal and tail fat of eight Assaf suckling lambs was used to compare the two tissues at the level of gene expression, cellular microenvironment, and alternative splicing. First, a DEA was performed with DESeq2, including the individual itself as a factor in the model. The 6,000 DEGs identified reflected that, at the age of slaughter, the perirenal tissue of suckling lambs shows an activated adipogenic regulation cascade, while the tail tissue shows a more mature metabolic profile, with enrichment in lipid biosynthesis pathways. Subsequently, through a deconvolution analysis performed using a single-nuclei RNA-Seq (snRNA-Seq) dataset from cow adipose tissue as a reference, the existence of a higher proportion of mature adipocytes in tail fat was confirmed. On the other hand, perirenal fat appeared less dijerentiated, with a greater abundance of preadipocytes, mesothelial, immune, pericytic, and smooth muscle cells, indicating an ongoing process of tissue expansion and remodelling. These findings reveal an early functional divergence between adipose deposits and demonstrate the usefulness of interspecies deconvolution analyses for studying adipose tissue specialisation in livestock species. Finally, alternative splicing analysis performed with the IsoformSwitchAnalyzeR R package detected 99,433 isoforms in the two adipose tissues analysed. For the 540 isoforms that showed a dijerent expression pattern between the two tissues, functional characterisation revealed complex deposit-specific regulation, including isoforms of key genes in adipogenesis, thermogenesis, and cell signalling. These results confirm that the functional identity of dijerent fat deposits is established at very early stages of development. In addition to achieving the specific objectives proposed in this doctoral thesis, visualizeGO was developed, an R package that enables the reduction of redundancy between gene ontology (GO) terms, to improve the functional interpretation of the results obtained in dijerent genomic studies. Considering the four main functions ojered by this package (clusterGO, compareGO, familyGO and visualizeGO), a comparison of the performance and results of the visualizeGO analysis with another R package commonly used for this type of analysis showed that the newly developed package ojers a certain improvement in redundancy reduction capacity, without altering the biological significance of the results. In addition, visualizeGO provides various options for comparing data sets and hierarchical visualisation of the results, allowing for better interpretation of the results. Overall, the results obtained in this Doctoral Thesis provide solid transcriptomic information on the genetic processes that determine or modulate adipose tissue development in sheep and constitute a starting point for the identification of functional candidate genes for fattening traits in this species. This knowledge represents a significant advance in the understanding of the genetic and molecular mechanisms associated with carcass quality traits in suckling lamb. The results highlight the relevance of the state of maturation of adipose tissue in the degree of fattening of the carcass and provide potential biomarkers indicative of the dijerent stages of development in suckling lambs. In addition, the methodological development ojered in this doctoral thesis demonstrates the value of integrating dijerent transcriptomic approaches for the study of complex biological traits of economic interest in livestock species.Proyecto QUALITYLAMB (LE084P23), financiado por la Junta de Castilla y León.Gutiérrez Gil, BeatrizSuárez Vega, AroaProducción AnimalFacultad de Veterinaria2025info:eu-repo/semantics/doctoralThesishttps://hdl.handle.net/10612/28010reponame:BULERIA. Repositorio Institucional de la Universidad de Leóninstname:Universidad de LeónEspañolinfo:eu-repo/grantAgreement/AEI/Programa Estatal de I+D+i Orientada a los Retos de la Sociedad/RTI2018-093535-B-I00http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccessoai:dnet:buleria_____::61ac88c30462660a645850533e018bbe2026-06-24T12:43:27Z
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