Plant cell bioreactors for peptide production
La producció de proteïnes recombinants en plantes representa una oportunitat per a la seva obtenció i utilització comercial. L'objectiu principal d'aquesta tesi industrial ha estat el desenvolupament de sistemes vegetals de producció de proteïnes, eficients i competitius econòmicament, amb...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2020 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/670804 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/670804 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Peptid Peptido Peptide Cultiu cellular Cultivo celular Cell culture Oleosina Oleosin Ciències Experimentals 00 |
| Sumario: | La producció de proteïnes recombinants en plantes representa una oportunitat per a la seva obtenció i utilització comercial. L'objectiu principal d'aquesta tesi industrial ha estat el desenvolupament de sistemes vegetals de producció de proteïnes, eficients i competitius econòmicament, amb possibilitats de portar-les al mercat. Per fer-ho hem explorat dos sistemes: els cultius cel·lulars de Daucus carota i les fulles de Nicotiana benthamiana, cadascun d'ells amb els seus avantatges i limitacions. Com a prova de concepte, ambdós sistemes van ser utilitzats per a la producció d'"insulin-like growth factor 1" (IGF1), un pèptid d'alt valor afegit per a les indústries cosmètica i farmacèutica. S'assajaren vàries estratègies innovadores per a millorar els rendiments de producció augmentant l'expressió gènica i reduir costos de purificació del producte. A més, l'activitat biològica de l'IGF1 i els seus derivats produïts en planta va ser avaluada en comparació amb pèptids sintètics. Com a primera estratègia s'assajaren supressors del silenciament de l'ARN d'origen viral per tal d'incrementar l'expressió gènica. En assajos d'expressió transitòria amb la proteïna verda fluorescent com a marcadora, seleccionàrem la proteïna P1b del ipomovirus Cucumber vein yellowing virus (CVYV). Els nostres resultats amb línies cel·lulars de pastanaga sobreexpressores de l'IGF1 o el seu pèptid derivat CPP-IGF1 (variant dissenyada per a millorar la seva penetració en cèl·lules humanes) mostraren que en combinació amb P1b s'arribava a rendiments de producció 4 vegades majors que les línies sense el supressor del silenciament. A més, els pèptids foren dirigits al medi de cultiu per facilitar el seu aïllament mitjançant una simple clarificació. En assajos d'activitat, les fraccions obtingudes confirmaren ser capaces d'incrementar la divisió de fibroblasts humans. En relació amb l'estabilitat de la producció, s'observà una reducció propera al 33% després de vint-i-un cicles de propagació successius, per la qual cosa s'implementà la criopreservació de les línies transgèniques per mantenir els rendiments de producció originals, i així establir bancs cel·lulars per usos futurs. Alhora, es desenvolupà un sistema de producció transitòria de l'IGF1 i el CPP-IGF1 en fulles de N. benthamiana utilitzant un vector derivat del virus del mosaic del tabac, Tobacco mosaic virus (TMV). Aquest sistema va permetre reduir el temps d'obtenció del pèptid actiu, encara que en comparació amb la producció a les línies cel·lulars l'obtenció del producte no fou tan senzilla. Per tal de facilitar la purificació de l'IGF1 a partir de les matrius vegetals, aplicàrem una estratègia innovadora basada en fusions a oleosina per dirigir la producció a cossos lipídics. Aquesta tecnologia ja havia estat utilitzada en llavors, però no en cultius cel·lulars i escassament en fulles. Les nostres observacions mostraren la presència d'abundants cossos lipídics en nombrosos cultius cel·lulars incloent-hi els de D. carota amb l'excepció de les dues espècies model analitzades, Nicotiana tabacum i Arabidopsis thaliana. Desafortunadament, l'expressió estable de fusions a l'oleosina sembla que va afectar greument al creixement dels calls cel·lulars, pel que s'exploraren alternatives de la seva aplicació a la producció en fulles. Per tal d'augmentar la quantitat de cossos lipídics, la producció de les fusions a l'oleosina es realitzà simultàniament amb la d'inductors de l'acumulació de triacilglicerols utilitzant elements clau de la seva ruta biosintètica en A. thaliana: l'enzim DGAT1 i el factor de transcripció WRI1. Quan ambdós inductors foren co-expressats en combinació amb fusions a oleosina i l'IGF1 en plantes de N. benthamiana, es va obtenir fins 1 μg/g d'IGF1 unit als cossos lipídics, fàcilment aïllable i actiu. El nostre treball proporciona evidències que la utilització de supressors del silenciament de l'ARN, els vectors virals i la tecnologia de les oleosines contribueixen al potencial de les matrius vegetals per a la producció de proteïnes d'interès. |
|---|