Aplicación de técnicas de proteómica para el estudio de enfermedades neuromusculares

En la actualidad la proteómica es una de las herramientas más utilizadas en el estudio de diferentes patologías. Los recientes avances en la proteómica incluyen desde la preparación de la muestra, la espectrometría de masas (MS) y el análisis de datos; convirtiendo esta tecnología en un método básic...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Torre Gómez, Carolina de la
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2012
País:España
Institución:CBUC, CESCA
Repositorio:TDR. Tesis Doctorales en Red
OAI Identifier:oai:www.tdx.cat:10803/83278
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10803/83278
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Enfermedades neuromusculares
Malalties neuromusculars
Neuromuscular diseases
Proteòmica
Proteómica
Proteomics
Electroforesis bidimensional
Electroforesi bidimensional
Two-dimensional electrophoresis
Inmunoproteómica
Immunoproteòmica
Immuno-proteomics
Ciències Experimentals i Matemàtiques
612
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description En la actualidad la proteómica es una de las herramientas más utilizadas en el estudio de diferentes patologías. Los recientes avances en la proteómica incluyen desde la preparación de la muestra, la espectrometría de masas (MS) y el análisis de datos; convirtiendo esta tecnología en un método básico para la investigación biomédica. La espectrometría de masas (MS) es la base de la proteómica, este campo ha evolucionado muy rápido, permitiendo en la actualidad realizar análisis cualitativos y cuantitativos de las proteínas, además de poder evaluar sus modificaciones post-, la localización subcelular y las interacciones de proteínas. En el desarrollo de este trabajo hemos introducido de manera muy sencilla algunas técnicas de proteómicas para abordar las preguntas diferentes preguntas relacionadas con la patología de las enfermedades neuromusculares. • Las enfermedades neuromusculares (ENM) comprenden un grupo heterogéneo de patologías que pueden afectar a la médula espinal del motor, y las raíces sensoriales, los nervios periféricos, unión neuromuscular y músculo esquelético. Las (ENM) constituyen un grave problema sanitario y social porque en un elevado porcentaje de casos producen invalidez por debilidad muscular progresiva y crónica. Estas enfermedades afectan tanto a personas adultas y ancianos como a jóvenes y niños y además de su efecto personal y familiar devastador tienen un elevadísimo coste económico. El diagnóstico de estas enfermedades se basa en el examen neurológico, pruebas electrofisiologícas, la resonancia magnética, biopsia del músculo y nervio y la detección de autoanticuerpos en el suero y liquido cefalorraquídeo del paciente. La técnica de proteómica que nos ha permitido identificar nuevas moléculas candidatas en alguna de la patologías neuromusculares estudiadas es la electroforesis bidimensional (2D-E) que dependiendo de nuestros objetivos la aplicamos con diversos esquemas, como lo describiremos: • Utilizamos la electroforesis bidimensional como una herramienta de estudio para identificar los cambios en la expresión de las proteínas en la muestra del paciente durante la progresión de la enfermedad y después de una intervención terapéutica. Hemos estudiado un paciente con escleromixedema, una mucinosis dérmica que en algunos casos también afecta al músculo esquelético. Incremento de la proliferación de fibroblastos de la piel asociada frecuentemente a una gammapatía monoclonal. El análisis de esta se ha realizado apartir de cultivos primarios de los fibroblastos del paciente antes enfermo y después del tratamiento. • Identificación de los antígenos diana de nuevos autoanticuerpos en el suero de pacientes con neuropatías inmunomediadas. Hemos combinado la electroforesis bidimensional y Western-blot con suero de paciente para identificar nuevos autoanticuerpos. En este trabajo se encontró una fuerte reactividad contra la P2, una proteína de la mielina. Los resultados fueron validados por ELISA. Nuestros datos amplían el espectro en las neuropatías disinmunes adquiridas y sugieren que la reactividad contra las proteínas de la mielina pueden estar relacionados con una implicación, sobre todo radicular, de una presentación clínica de ataxia sensitiva y alteración motora que se asemeja clínicamente CIDP. • El uso de geles de electroforesis bidimensionales, en un estudio comparativo del perfil de expresión proteica en músculos esqueléticos de controles sanos y pacientes afectos con distintas distrofias musculares (disfelinopatia, calpainopatia, facioescapulohumeral), para identificar proteínas diferencialmente expresadas y específicas en cada una de ellas. Este estudio nos mostro proteínas que eran comúnmente expresadas en todas las distrofias estudiadas y diferencialmente del musculo control. Nosotros centramos nuestros resultados a evaluar las proteínas que eran especificas de la disferlinopatia, y encontramos Incremento en la expresión de las proteínas contráctiles fosforiladas específicas de las fibras tipo I (TPN1, TPM1) lo que sugiere un proceso de transición de tipo de fibra en los pacientes con disferlinopatía. Una sobreexpresión de Rho GDI afecta los niveles de expresión de miogenina proteína necesaria para la diferenciación celular. Lo más relevante de este trabajo fue el hallazgo de una nueva proteína la TRIM 72 incrementada en los pacientes con disferlinopatia, proteína que no se conocía en ese momento su función y que un año más tarde salieron 2 artículos en las indican que esta participa en la reparación de la membrana al igual que la disferlina de hecho estas proteínas forman parte de un mismo complejo implicado en procesos de reparación. Por lo tanto un incremento de la expresión de TRIM 72 en nuestro trabajo sugiere un mecanismo compensatorio por la ausencia de disferlina.
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La espectrometría de masas (MS) es la base de la proteómica, este campo ha evolucionado muy rápido, permitiendo en la actualidad realizar análisis cualitativos y cuantitativos de las proteínas, además de poder evaluar sus modificaciones post-, la localización subcelular y las interacciones de proteínas. En el desarrollo de este trabajo hemos introducido de manera muy sencilla algunas técnicas de proteómicas para abordar las preguntas diferentes preguntas relacionadas con la patología de las enfermedades neuromusculares. • Las enfermedades neuromusculares (ENM) comprenden un grupo heterogéneo de patologías que pueden afectar a la médula espinal del motor, y las raíces sensoriales, los nervios periféricos, unión neuromuscular y músculo esquelético. Las (ENM) constituyen un grave problema sanitario y social porque en un elevado porcentaje de casos producen invalidez por debilidad muscular progresiva y crónica. Estas enfermedades afectan tanto a personas adultas y ancianos como a jóvenes y niños y además de su efecto personal y familiar devastador tienen un elevadísimo coste económico. El diagnóstico de estas enfermedades se basa en el examen neurológico, pruebas electrofisiologícas, la resonancia magnética, biopsia del músculo y nervio y la detección de autoanticuerpos en el suero y liquido cefalorraquídeo del paciente. La técnica de proteómica que nos ha permitido identificar nuevas moléculas candidatas en alguna de la patologías neuromusculares estudiadas es la electroforesis bidimensional (2D-E) que dependiendo de nuestros objetivos la aplicamos con diversos esquemas, como lo describiremos: • Utilizamos la electroforesis bidimensional como una herramienta de estudio para identificar los cambios en la expresión de las proteínas en la muestra del paciente durante la progresión de la enfermedad y después de una intervención terapéutica. Hemos estudiado un paciente con escleromixedema, una mucinosis dérmica que en algunos casos también afecta al músculo esquelético. Incremento de la proliferación de fibroblastos de la piel asociada frecuentemente a una gammapatía monoclonal. El análisis de esta se ha realizado apartir de cultivos primarios de los fibroblastos del paciente antes enfermo y después del tratamiento. • Identificación de los antígenos diana de nuevos autoanticuerpos en el suero de pacientes con neuropatías inmunomediadas. Hemos combinado la electroforesis bidimensional y Western-blot con suero de paciente para identificar nuevos autoanticuerpos. En este trabajo se encontró una fuerte reactividad contra la P2, una proteína de la mielina. Los resultados fueron validados por ELISA. Nuestros datos amplían el espectro en las neuropatías disinmunes adquiridas y sugieren que la reactividad contra las proteínas de la mielina pueden estar relacionados con una implicación, sobre todo radicular, de una presentación clínica de ataxia sensitiva y alteración motora que se asemeja clínicamente CIDP. • El uso de geles de electroforesis bidimensionales, en un estudio comparativo del perfil de expresión proteica en músculos esqueléticos de controles sanos y pacientes afectos con distintas distrofias musculares (disfelinopatia, calpainopatia, facioescapulohumeral), para identificar proteínas diferencialmente expresadas y específicas en cada una de ellas. Este estudio nos mostro proteínas que eran comúnmente expresadas en todas las distrofias estudiadas y diferencialmente del musculo control. Nosotros centramos nuestros resultados a evaluar las proteínas que eran especificas de la disferlinopatia, y encontramos Incremento en la expresión de las proteínas contráctiles fosforiladas específicas de las fibras tipo I (TPN1, TPM1) lo que sugiere un proceso de transición de tipo de fibra en los pacientes con disferlinopatía. Una sobreexpresión de Rho GDI afecta los niveles de expresión de miogenina proteína necesaria para la diferenciación celular. Lo más relevante de este trabajo fue el hallazgo de una nueva proteína la TRIM 72 incrementada en los pacientes con disferlinopatia, proteína que no se conocía en ese momento su función y que un año más tarde salieron 2 artículos en las indican que esta participa en la reparación de la membrana al igual que la disferlina de hecho estas proteínas forman parte de un mismo complejo implicado en procesos de reparación. Por lo tanto un incremento de la expresión de TRIM 72 en nuestro trabajo sugiere un mecanismo compensatorio por la ausencia de disferlina.Proteomic techniques application to study neuromuscular diseases Nowadays, proteomics constitutes one of the most frequently used tools to study human diseases. Recent advances in proteomics, including sample preparation, mass spectrometry and data analysis, make this technology a central approach for biomedical research. Mass spectrometry is the basis for proteomics. This field has evolved very fast in terms of development of qualitative and quantative analysis of proteins, dissection of post-translational modifications and unravelling subcellular location and interactions between proteins. Neuromuscular diseases encompass a heterogeneous group of pathologies that can affect from the spinal cord, motor and sensory roots, peripheral nerves, neuromuscular junction and skeletal muscle. Neuromuscular diseases have a high impact on the health system and society because in many cases they lead to patient’s disability due to a progressive muscle weakness. The diagnosis of these diseases is based on neurological examination, electrophysiology, muscle MRI, nerve or muscle biopsy and detection of autoantibodies in patient’s sera. In this thesis we have applied different proteomic strategies to address questions related to the pathophysiology of the neuromuscular diseases studied: • The use of bidimensional electrophoresis as a tool to identify changes in protein expression in patient’s sample during the progression of the disease and after a therapeutic intervention. We have studied a patient with scleromyxedema, a dermic mucinosis that in some cases also affects skeletal muscle. Analysis of fibroblasts proliferation has been analyzed before and after treatment. • Identification of new target antigens of autoantibodies in the sera of patients with immune-mediated neuropathies. We have combined bidimensional electrophoresis and Western-blot and found autoantibodies against P2, a myelin protein. Results were validated by ELISA • The use of bidimensional electrophoresis gels stained with different dyes to perform a qualitative and quantitative analysis of different muscular dystrophies. We found changes common to all dystrophic samples and differential expression of some proteins specific for each muscular dystrophy. .Universitat de BarcelonaGallardo Vigo, Eduard201220122012info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion179 p.application/pdfapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10803/83278TDX (Tesis Doctorals en Xarxa)reponame:TDR. Tesis Doctorales en Redinstname:CBUC, CESCAEspañolADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). 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