Estudio de la producción heteróloga de una lipasa del hongo Rhizopus oryzae en la levadura metilotrófica Pichia pastoris
El trabajo recoge los principales aspectos de la producción recombinante de una lipasa del hongo Rhizopus oryzae (ROL) expresada en la levadura Pichia pastoris. El sistema de expresión empleado está basado en la utilización del promotor de la alcohol oxidasa (PAOX1) de la levadura y, por lo tanto es...
| Author: | |
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| Format: | doctoral thesis |
| Status: | Published version |
| Publication Date: | 2002 |
| Country: | España |
| Institution: | CBUC, CESCA |
| Repository: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/3171 |
| Online Access: | http://www.tdx.cat/TDX-0701104-165829 http://hdl.handle.net/10803/3171 |
| Access Level: | Open access |
| Keyword: | Recombinante Expresión Pichia Ciències Experimentals 57 |
| Summary: | El trabajo recoge los principales aspectos de la producción recombinante de una lipasa del hongo Rhizopus oryzae (ROL) expresada en la levadura Pichia pastoris. El sistema de expresión empleado está basado en la utilización del promotor de la alcohol oxidasa (PAOX1) de la levadura y, por lo tanto es dependiente de la utilización de metanol como substrato inductor. El trabajo recoge una serie de estudios de producción en bioreactor, operando en fed-batch, en los que la productividad del sistema se incrementa hasta en un factor de 11, mediante el estudio de la estrategia de adición del metanol a lo largo de la etapa de producción. Asimismo, estos cultivos se han realizado utilizando un medio de composición sintética, mucho mas económico que el complejo. La optimización de la producción también se ha abordado mediante la construcción de cepas multicopia para el gen ROL, estudiando igualmente, el efecto de la expresión recombinante de la lipasa sobre la cepa hospedadota.<br/>Por otro lado, se han construido vectores de expresión basados en la utilización de promotores independientes de la utilización del metanol. Se han obtenido cepas de P. pastoris que expresan la ROL de forma constitutiva y mediante inducción por fuente de nitrógeno.<br/>El trabajo recoge en último lugar un protocolo para la recuperación de la ROL recombinante desde el caldo de cultivo hasta la obtención de un extracto liofilizado de lipasa ROL. La purificación de la lipasa se ha llevado a acabo a través de la combinación de los pasos de cromatografía, de intercambio catiónico e interacción hidrofóbica. El grado de pureza obtenido es el adecuado para la utilización de la enzima como biocatalizador en reacciones de química fina y para la obtención de anticuerpos contra la misma. |
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