Modulación funciónal de hemicanales formados por conexinas por estímulos de distinta naturaleza

Las conexinas (Cxs) son una familia de al menos 21 proteínas integrales detransmembrana que forman los canales intercelulares de las uniones en hendidura o"gap junctions" en vertebrados. Los canales de las uniones en hendidura (CUH) seforman a partir de la unión en serie de dos hemicanales...

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Detalhes bibliográficos
Autor: Schalper-Casanova, Kurt Alex
Formato: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2008
País:Chile
Idioma:español
OAI Identifier:oai:repositorio.anid.cl:10533/182369
Acesso em linha:http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/
https://hdl.handle.net/10533/182369
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description Las conexinas (Cxs) son una familia de al menos 21 proteínas integrales detransmembrana que forman los canales intercelulares de las uniones en hendidura o"gap junctions" en vertebrados. Los canales de las uniones en hendidura (CUH) seforman a partir de la unión en serie de dos hemicanales (HCs) provenientes de células adyacentes, cuyas paredes se encuentran a su vez formadas por dominiosde 6 subunidades proteicas, que oligomerizan alrededor de un poro central. Los HCspueden constituirlos una sola variedad de Cxs (homoméricos) o más de una(heteroméricos). Una fracción de los HCs se localiza en zonas de la membrana queno establecen contactos intercelulares y presentan funciones independientes de losCUH. Recientemente se demostró que proteínas de otra familia, denominadaspanexinas (Pxs), forman HCs funcionales en células de mamíferos, pero suspropiedades y funciones permanecen aún poco estudiadas. En condiciones dereposo, los HCs formados por la mayor parte de las Cxs estudiadas presentan bajaactividad. Entre las condiciones experimentales que modifican la actividad de losHCs, se incluyen cambios en la concentración extracelular de cationes mono ydivalentes, intracelular de W, osmolaridad extracelular, estado de fosforilación de lasCxs, potencial de transmembrana, inhibición metabólica química (IM), tratamientocon citoquinas pro-inflamatorias y bloqueadores de los CUH. Los HCs activados sonpermeables a ciertos trazadores fluorescentes y moléculas pequeñas de importanciabiológica como, NAD+, ATP, glutamato, ácido ascórbico, prostaglandina E2, glucosay glutatión. Desde su descubrimiento, los HCs formados por diversas Cxs han sidovinculados a procesos celulares patológicos como la muerte celular por lisisosmótica, isquemia y mutaciones de Cxs. Estudios recientes han revelado que losHCs participan también en procesos no asociados a muerte celular como laregulación del volumen celular, el precondicionamiento isquémico y la proliferacióncelular durante el neurodesarrollo. Los determinantes celulares y moleculares que explican la participación de los HCs en procesos tan disímiles como la sobrevida y lamuerte celular no se conocen. La mayor parte de los estudios que muestranaumento en la actividad de HCs han utilizado protocolos experimentales distantes dela fisiología como la exposición de células a medios libres de Ca2+ y Mg2+ opotenciales de membrana positivos muy distantes del potencial de reposo. Seconocen pocas condiciones que aumentan el estado funcional de los HCs enpresencia de cationes divalentes y a potenciales de membrana de reposo, entre losque incluyen la IM, el tratamiento con bifosfonatos, la estimulación mecánica y elaumento de la concentración de Ca2+ libre intracelular ([Ca2+]¡). Hasta el comienzode esta tesis, no se habían identificado ligandos endógenos o factores solubles quemodifiquen el estado funcional de HCs formados por Cxs en presencia deconcentraciones extracelulares fisiológicas de cationes divalentes. Durante el trabajopreliminar de esta tesis se demostró que el factor de crecimiento fibroblástico de tipo1 (FGF-1) aumenta la captación del colorante etidio a través de HCs formados por laCx43 (HCs-Cx43) en presencia de cationes divalentes extracelulares.Adicionalmente, datos de nuestro laboratorio revelaron que los HCs-Cx43 sonactivados por cambios del potencial redox intracelular en idénticas condicionesexperimentales.En esta tesis se propuso como hipótesis que: "Estímulos como FGF-1,cambios del potencial redox intracelular con DTT o IM aumentan lapermeabilización celular mediada por los HCs-Cx43 en presencia deconcentraciones extracelulares fisiológicas de cationes divalentes pormecanismos distintos. Los estímulos afectan diferencialmente a HCsformados por Cxs distintas y la naturaleza del estímulo determina lascaracterísticas de la respuesta de permeabilización celular".Los datos obtenidos en esta tesis permiten concluir que: i) FGF-1 aumentatransitoriamente la permeabilidad celular mediada por los HCs-Cx43 en presencia deconcentraciones fisiológicas de cationes divalentes, pero paralelamente reduce el acoplamiento intercelular mediado por los euH. ii) La respuesta inducida por elFGF-1 es ex-específica, ya que afecta Hes formados por ex43 o ex45 pero noafecta Hes formados por ex26. iii) Tanto aminoácidos presentes en el extremocarboxilo terminal de las exs 43 y 45, pero ausentes en la ex26, como el incrementoen la [ea2+]¡ median la respuesta a la estimulación con el factor de crecimientocelular. iv) La permeabilización celular inducida por FGF-1 se debe principalmente aun aumento en la cantidad relativa de Hes en la membrana plasmática. v) Ladisminución del potencial redox intracelular con DTT incrementa el estado funcionalde Hes-ex43 en presencia de cationes divalentes extracelulares, a través de unmecanismo diferente al activado por FGF-1 , basado en un aumento de laprobabilidad de apertura de los Hes-ex43. vi) El efecto inducido por DTT es rápido,independiente de la [ea2+]¡, pero dependiente de residuos de aminoácidos presentesen el extremo e-terminal de la ex43. vii) El DTT afecta en sentido opuesto el estadofuncional de los Hes-ex43 en células normales (controles y tratadas con FGF-1) yen células sometidas a IM (aumenta y disminuye, respectivamente) . vii1) La IMinduce permeabilización celular mediada por Hes-ex43 y aumenta progresivamentela [ea2+]¡ en presencia de concentraciones fisiológicas de cationes divalentes en elmedio extracelular. Dicho efecto es más pronunciado que el de FGF-1 o DTT. ix) LaIM aumenta la actividad de los Hes en células transfectadas con las exs 26, 43 o45 y se asocia a un incremento en los niveles de Hes en la superficie celular. x) Elefecto inducido por IM depende parcialmente de la presencia residuos aminoacídicos del extremo e-terminal de la ex43 y del incremento en la [ea2+]L xi) LosHes-ex43 presentan distinta selectividad al paso de trazadores catiónicos conpropiedades físico-químicas diferentes. xi1) Los Hes formados por las exs 26 o 43son activados por alcalinización extracelular y son permeables a ea2+.En esta tesis se revela un aumento en la permeabilidad de la membrana celularmediado por los Hes-ex43 ante estímulos de distinta naturaleza en presencia deconcentraciones fisiológicas de cationes divalentes y se aporta al entendimiento delos mecanismos moleculares que median dichos cambios. Los mecanismosidentificados operan en segmentos diferentes de las Cxs que forman los HCs, lo quesugiere que la presencia de múltiples Cxs con diferencias estructurales permite quecumplan funciones que se adaptan a las de cada tipo celular. La presencia de efectosdiferentes dependiendo del estímulo y la Cx que constituye los HCs en la célula,demuestran un nivel de complejidad de este sistema de comunicación celular,previamente desconocido.La demostración del paso de un segundo mensajero, como el Ca2+, a través deHCs-Cxs activados no solo agrega un nuevo elemento a la lista de compuestos quecruzan los HCs, sino que también abre un nuevo espectro en el estudio de laseñalización y consecuencias celulares derivadas de la activación de los HCs-Cxs.
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Una fracción de los HCs se localiza en zonas de la membrana queno establecen contactos intercelulares y presentan funciones independientes de losCUH. Recientemente se demostró que proteínas de otra familia, denominadaspanexinas (Pxs), forman HCs funcionales en células de mamíferos, pero suspropiedades y funciones permanecen aún poco estudiadas. En condiciones dereposo, los HCs formados por la mayor parte de las Cxs estudiadas presentan bajaactividad. Entre las condiciones experimentales que modifican la actividad de losHCs, se incluyen cambios en la concentración extracelular de cationes mono ydivalentes, intracelular de W, osmolaridad extracelular, estado de fosforilación de lasCxs, potencial de transmembrana, inhibición metabólica química (IM), tratamientocon citoquinas pro-inflamatorias y bloqueadores de los CUH. Los HCs activados sonpermeables a ciertos trazadores fluorescentes y moléculas pequeñas de importanciabiológica como, NAD+, ATP, glutamato, ácido ascórbico, prostaglandina E2, glucosay glutatión. Desde su descubrimiento, los HCs formados por diversas Cxs han sidovinculados a procesos celulares patológicos como la muerte celular por lisisosmótica, isquemia y mutaciones de Cxs. Estudios recientes han revelado que losHCs participan también en procesos no asociados a muerte celular como laregulación del volumen celular, el precondicionamiento isquémico y la proliferacióncelular durante el neurodesarrollo. Los determinantes celulares y moleculares que explican la participación de los HCs en procesos tan disímiles como la sobrevida y lamuerte celular no se conocen. La mayor parte de los estudios que muestranaumento en la actividad de HCs han utilizado protocolos experimentales distantes dela fisiología como la exposición de células a medios libres de Ca2+ y Mg2+ opotenciales de membrana positivos muy distantes del potencial de reposo. Seconocen pocas condiciones que aumentan el estado funcional de los HCs enpresencia de cationes divalentes y a potenciales de membrana de reposo, entre losque incluyen la IM, el tratamiento con bifosfonatos, la estimulación mecánica y elaumento de la concentración de Ca2+ libre intracelular ([Ca2+]¡). Hasta el comienzode esta tesis, no se habían identificado ligandos endógenos o factores solubles quemodifiquen el estado funcional de HCs formados por Cxs en presencia deconcentraciones extracelulares fisiológicas de cationes divalentes. Durante el trabajopreliminar de esta tesis se demostró que el factor de crecimiento fibroblástico de tipo1 (FGF-1) aumenta la captación del colorante etidio a través de HCs formados por laCx43 (HCs-Cx43) en presencia de cationes divalentes extracelulares.Adicionalmente, datos de nuestro laboratorio revelaron que los HCs-Cx43 sonactivados por cambios del potencial redox intracelular en idénticas condicionesexperimentales.En esta tesis se propuso como hipótesis que: "Estímulos como FGF-1,cambios del potencial redox intracelular con DTT o IM aumentan lapermeabilización celular mediada por los HCs-Cx43 en presencia deconcentraciones extracelulares fisiológicas de cationes divalentes pormecanismos distintos. Los estímulos afectan diferencialmente a HCsformados por Cxs distintas y la naturaleza del estímulo determina lascaracterísticas de la respuesta de permeabilización celular".Los datos obtenidos en esta tesis permiten concluir que: i) FGF-1 aumentatransitoriamente la permeabilidad celular mediada por los HCs-Cx43 en presencia deconcentraciones fisiológicas de cationes divalentes, pero paralelamente reduce el acoplamiento intercelular mediado por los euH. ii) La respuesta inducida por elFGF-1 es ex-específica, ya que afecta Hes formados por ex43 o ex45 pero noafecta Hes formados por ex26. iii) Tanto aminoácidos presentes en el extremocarboxilo terminal de las exs 43 y 45, pero ausentes en la ex26, como el incrementoen la [ea2+]¡ median la respuesta a la estimulación con el factor de crecimientocelular. iv) La permeabilización celular inducida por FGF-1 se debe principalmente aun aumento en la cantidad relativa de Hes en la membrana plasmática. v) Ladisminución del potencial redox intracelular con DTT incrementa el estado funcionalde Hes-ex43 en presencia de cationes divalentes extracelulares, a través de unmecanismo diferente al activado por FGF-1 , basado en un aumento de laprobabilidad de apertura de los Hes-ex43. vi) El efecto inducido por DTT es rápido,independiente de la [ea2+]¡, pero dependiente de residuos de aminoácidos presentesen el extremo e-terminal de la ex43. vii) El DTT afecta en sentido opuesto el estadofuncional de los Hes-ex43 en células normales (controles y tratadas con FGF-1) yen células sometidas a IM (aumenta y disminuye, respectivamente) . vii1) La IMinduce permeabilización celular mediada por Hes-ex43 y aumenta progresivamentela [ea2+]¡ en presencia de concentraciones fisiológicas de cationes divalentes en elmedio extracelular. Dicho efecto es más pronunciado que el de FGF-1 o DTT. ix) LaIM aumenta la actividad de los Hes en células transfectadas con las exs 26, 43 o45 y se asocia a un incremento en los niveles de Hes en la superficie celular. x) Elefecto inducido por IM depende parcialmente de la presencia residuos aminoacídicos del extremo e-terminal de la ex43 y del incremento en la [ea2+]L xi) LosHes-ex43 presentan distinta selectividad al paso de trazadores catiónicos conpropiedades físico-químicas diferentes. xi1) Los Hes formados por las exs 26 o 43son activados por alcalinización extracelular y son permeables a ea2+.En esta tesis se revela un aumento en la permeabilidad de la membrana celularmediado por los Hes-ex43 ante estímulos de distinta naturaleza en presencia deconcentraciones fisiológicas de cationes divalentes y se aporta al entendimiento delos mecanismos moleculares que median dichos cambios. 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