Estudio de la acción no genómica del receptor de progesterona en el proceso de maduración del ovocito de xenopus laevis

Las hormonas esteroidales llevan a cabo la mayoría de sus acciones, y subsecuentes actividades biológicas, modulando la transcripción de células blanco a través de su interacción con receptores ubicados en el citoplasma o núcleo. Este mecanismo de acción se conoce como "clásico" o "ge...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Martínez-Gallegos, Silvana Paola
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2008
País:Chile
Idioma:español
OAI Identifier:oai:repositorio.anid.cl:10533/180098
Acceso en línea:http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/
https://hdl.handle.net/10533/180098
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Hinrichs-R, María Victoria
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description Las hormonas esteroidales llevan a cabo la mayoría de sus acciones, y subsecuentes actividades biológicas, modulando la transcripción de células blanco a través de su interacción con receptores ubicados en el citoplasma o núcleo. Este mecanismo de acción se conoce como "clásico" o "genómico". Sin embargo, en los últimos añ.os, se ha acumulado importante evidencia que sugiere que muchos esteroides inducirían cascadas de señalización independiente de la transcripción, el cual se ha denominado "mecanismo de acción no genómico o no clásico". Un proceso fisiológicamente importante que claramente depende de mecamsmos no genómicos, es la maduración de ovocitos de anfibios inducida por progesterona. Esta hormona esteroidal promueve en los ovocitos la reiniciación del ciclo celular, que se caracteriza por la ruptura de su vesícula germinal (GVBD), sistema que representan un excelente modelo de estudio por su gran tamañ.o, su fácil manipulación y visualización del proceso de maduración a través de la aparición del GVBD. Trabajos previos sugieren que el mecanismo de acción de progesterona en los ovocitos sería diferente al modo de acción clásico y se ha propuesto que el esteroide interaccionaría con un receptor de membrana plasmática, lo que conduciría a la inhibición del sistema efector adenilil ciclasa, a la disminución en los niveles intracelulares de AMP cíclico y a la posterior maduración del ovocito. Actualmente existe una gran controversia con respecto a la identidad del receptor de progesterona que estaría participando en el proceso de maduración meiótica en el ovocito. Al respecto, se ha postulado que sería el mismo receptor clásico citosólico (xPR-1) el que estaría mediando la acción del esteroide a nivel de la membrana plasmática. Sin embargo, el principal problema que presenta esta hipótesis, es poder demostrar la localización de xPR-1 a nivel de la membrana plasmática del ovocito. Por lo tanto, el objetivo central de esta tesis, fue estudiar la localización subcelular del receptor clásico de progesterona, xPR-1, e identificar el mecanismo involucrado en su asociación a la membrana. Con este propósito, el receptor se expresó en ovocitos de Xenopus laevis y se estudió: a) su efecto en la maduración inducida por progesterona y b) su distribución subcelular. Además, xPR-1 se expresó en células Cos-7 en fusión a un epitope myc, para determinar mediante análisis de inmunocitoquímica su localización intracelular. Para determinar el o los mecanismos involucrados en la asociación del receptor a la membrana se analizó si xPR-1 era palmitoilado, a través de la incorporación de ácido palmítico tritiado, o si éste interaccionaba con proteínas de tipo "scaffold", como caveolina. Además, se trató de identificar a través de ensayos de coinmunoprecipitación y de purificación por cromatografia de afinidad en tandem (TAP-TAG), proteínas que interaccionaran con xPR-1. Los principales resultados obtenidos en esta tesis fueron los siguientes: 1) Se detectó en extracto de ovocitos una muy baja expresión de xPR-1 endógeno y solamente en la fracción citosólica. 2) Al sobreexpresar xPR-1 en ovocitos se encontró, además de una gran cantidad de proteína citosólica, una pequeña fracción de receptor asociada a la membrana plasmática, observándose también un aumento en el número de ovocitos que maduraron en relación con los ovocitos control. 3) La adición de una señal de miristoilación y palmitoilación en el extremo amino terminal de xPR-1 (mp-xPR-1), aumentó como era de esperar la cantidad de receptor asociado a la membrana y además incrementó significativamente la sensibilidad de los ovocitos a progesterona, validando su función a nivel de la membrana plasmática. 4) Al sobreexpresar xPR-1 en células Cos-7, se observó una fracción del receptor asociado a la membrana plasmática de las células, las cuales además adquirieron la capacidad de unir el ligando progesterona-BSA-FITC, que es impermeable a las células. 5) La mitad C-terminal de xPR-1, que incluye el DBD y el LBD, y el dominio LBD de xPR -1 se asociaron a la membrana plasmática, mientras que la región N-terminal de éste, se localizó sólo en el citosol de la célula. 6) No se observó incorporación de ácido palmítico en xPR-1 y la mutación del residuo de cisteína 619 no generó cambios en su asociación a la membrana ni en la cinética de maduración. 7) Se observó interacción de xPR-1 con caveolina-1, tanto en ausencia como en presencia de progesterona. 8) Gf3 fue coinmunoprecipitada y copurificadajunto a xPR-1, lo cual sugiere que el receptor estaría interaccionando con el dímero G¡3y en la ausencia de progesterona.
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Trabajos previos sugieren que el mecanismo de acción de progesterona en los ovocitos sería diferente al modo de acción clásico y se ha propuesto que el esteroide interaccionaría con un receptor de membrana plasmática, lo que conduciría a la inhibición del sistema efector adenilil ciclasa, a la disminución en los niveles intracelulares de AMP cíclico y a la posterior maduración del ovocito. Actualmente existe una gran controversia con respecto a la identidad del receptor de progesterona que estaría participando en el proceso de maduración meiótica en el ovocito. Al respecto, se ha postulado que sería el mismo receptor clásico citosólico (xPR-1) el que estaría mediando la acción del esteroide a nivel de la membrana plasmática. Sin embargo, el principal problema que presenta esta hipótesis, es poder demostrar la localización de xPR-1 a nivel de la membrana plasmática del ovocito. Por lo tanto, el objetivo central de esta tesis, fue estudiar la localización subcelular del receptor clásico de progesterona, xPR-1, e identificar el mecanismo involucrado en su asociación a la membrana. Con este propósito, el receptor se expresó en ovocitos de Xenopus laevis y se estudió: a) su efecto en la maduración inducida por progesterona y b) su distribución subcelular. Además, xPR-1 se expresó en células Cos-7 en fusión a un epitope myc, para determinar mediante análisis de inmunocitoquímica su localización intracelular. Para determinar el o los mecanismos involucrados en la asociación del receptor a la membrana se analizó si xPR-1 era palmitoilado, a través de la incorporación de ácido palmítico tritiado, o si éste interaccionaba con proteínas de tipo "scaffold", como caveolina. Además, se trató de identificar a través de ensayos de coinmunoprecipitación y de purificación por cromatografia de afinidad en tandem (TAP-TAG), proteínas que interaccionaran con xPR-1. Los principales resultados obtenidos en esta tesis fueron los siguientes: 1) Se detectó en extracto de ovocitos una muy baja expresión de xPR-1 endógeno y solamente en la fracción citosólica. 2) Al sobreexpresar xPR-1 en ovocitos se encontró, además de una gran cantidad de proteína citosólica, una pequeña fracción de receptor asociada a la membrana plasmática, observándose también un aumento en el número de ovocitos que maduraron en relación con los ovocitos control. 3) La adición de una señal de miristoilación y palmitoilación en el extremo amino terminal de xPR-1 (mp-xPR-1), aumentó como era de esperar la cantidad de receptor asociado a la membrana y además incrementó significativamente la sensibilidad de los ovocitos a progesterona, validando su función a nivel de la membrana plasmática. 4) Al sobreexpresar xPR-1 en células Cos-7, se observó una fracción del receptor asociado a la membrana plasmática de las células, las cuales además adquirieron la capacidad de unir el ligando progesterona-BSA-FITC, que es impermeable a las células. 5) La mitad C-terminal de xPR-1, que incluye el DBD y el LBD, y el dominio LBD de xPR -1 se asociaron a la membrana plasmática, mientras que la región N-terminal de éste, se localizó sólo en el citosol de la célula. 6) No se observó incorporación de ácido palmítico en xPR-1 y la mutación del residuo de cisteína 619 no generó cambios en su asociación a la membrana ni en la cinética de maduración. 7) Se observó interacción de xPR-1 con caveolina-1, tanto en ausencia como en presencia de progesterona. 8) Gf3 fue coinmunoprecipitada y copurificadajunto a xPR-1, lo cual sugiere que el receptor estaría interaccionando con el dímero G¡3y en la ausencia de progesterona.PFCHA-BecasDoctor en Ciencias Biológicas Mención Biología Celular y Molecular149 p.PFCHA-BecasTERMINADAhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/https://hdl.handle.net/10533/180098spainstname: Conicytreponame: Repositorio Digital RI2.0instname: Conicytreponame: Repositorio Digital RI2.0handle/10533/108040info:eu-repo/grantAgreement/PFCHA-Becas/RI20info:eu-repo/semantics/dataset/hdl.handle.net/10533/93488Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 Chileinfo:eu-repo/semantics/openAccessEstudio de la acción no genómica del receptor de progesterona en el proceso de maduración del ovocito de xenopus laevisTesis Doctoradoinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionTesisTesishttps://hdl.handle.net/10533/180098PFCHA-BecasORIGINALMARTINEZ_SILVANA_1186D.pdfapplication/pdf52821162https://repositorio.anid.cl/bitstreams/c10474a8-3182-40b6-b3b6-2364fc4eca5c/downloadc10e91b0946eaaa4f63e3db686f5b7d3MD51TEXTMARTINEZ_SILVANA_1186D.pdf.txtExtracted texttext/plain223424https://repositorio.anid.cl/bitstreams/f0572dc6-3c2b-499d-a029-effb705a8816/download7fe161f94358fcfad21c27d1971822c7MD52THUMBNAILMARTINEZ_SILVANA_1186D.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg2394https://repositorio.anid.cl/bitstreams/6021c8db-9e49-4635-aa0e-4e1bd6e3eb7e/download941be08597e9d0656c156179e3648896MD5310533/180098oai:repositorio.anid.cl:10533/1800982023-07-24 06:41:12.158https://repositorio.anid.clRepositorio ANIDaletelier@anid.cl
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