Identificación de nuevos genes involucrados en el establecimiento del patrón dorso-ventral de xenopus mediante sage (análisis en serie de la expresión génica).

El establecimiento del patrón dorso-ventral ha sido ampliamente estudiado en Xenopus, uno de los modelos más utilizados para entender el desarrollo embrionario de los vertebrados. Desde el descubrimiento del organizador de Spemann, reglón del embrión capaz de generar un eje dorsal secundario cuando...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Faunes-Quinteros, Fernando Emerson
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2009
País:Chile
Idioma:español
OAI Identifier:oai:repositorio.anid.cl:10533/179053
Acceso en línea:http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/
https://hdl.handle.net/10533/179053
Access Level:acceso abierto
Descripción
Sumario:El establecimiento del patrón dorso-ventral ha sido ampliamente estudiado en Xenopus, uno de los modelos más utilizados para entender el desarrollo embrionario de los vertebrados. Desde el descubrimiento del organizador de Spemann, reglón del embrión capaz de generar un eje dorsal secundario cuando se transpianta en la región ventral, muchas búsquedas de genes se han realizado y hoy se conocen varios genes involucrados en el establecimiento del patrón dorso-ventral. Estas búsquedas fueron realizadas antes de disponer de la secuencia genómica y, si bien han sido exitosas, no han sido exhaustivas y han estado sesgadas a la detección de los transcritos más abundantes, los más activos o los dependientes de la vía Wnt/13-catenina. La evidencia reciente derivada de las aproximaciones globales de expresión génica indica que los transcriptomas son mucho más complejos de lo que se pensaba anteriormente y demuestra que los estudios globales de expresión génica son herramientas valiosas para identificar nuevos genes. En esta Tesis se utilizó la metodología SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) con el objetivo de identificar nuevos genes involucrados en el establecimiento del patrón dorsoventral, realizando una comparación del transcriptoma dorsal y ventral en el estadío de gástrula de X. tropicalis. La asignación de los 23,766 tags experimentales obtenidos mediante SAGE fue realizada utilizando la secuencia genómica y las bases de datos de transcritos de X. tropicalis, de acuerdo a un protocolo modificado de Asignación Génica Jerárquica (HGA). De los 23,455 tags experimentales encontrados en el genoma, sólo el 54.5% pudo ser asignado a transcritos en forma confiable. El restante 45.5% de los tags experimentales probablemente deriva de transcritos nuevos, indicando que la anotación actual del genoma de X tropicalis se encuentra aún incompleta. Los tags esperados de genes con diferencia de expresión descrita en el eje dorsoventral en las genotecas dorsal y ventral presentaron la distribución esperada, indicando que las genotecas fueron preparadas correctamente. Para identificar nuevos transcritos con diferencia de expresión en el eje dorso-ventral, se generó un conjunto de 125 tags experimentales con diferencia significativa de frecuencia de ocurrencia entre ambas genotecas. De estos 125 tags, 21 tags fueron seleccionados para verificar experimentalmente la diferencia de expresión en el eje dorso-ventral. Además de la asignación in si/ico, se utilizó la aproximación experimental SAGE reverso, que permite alargar experimentalmente la secuencia de un tag de interés para asignar el tag a una posición genómica en particular. Del conjunto de 21 tags, 20 tags pudieron ser asignados en forma confiable, mediante bioinformática o SAGE reverso. Cinco de los 20 tags fueron asignados a genes con diferencia de expresión conocida en el eje dorso-ventral. Los restantes 15 tags fueron asignados a transcritos nuevos sin diferencia de expresión descrita previamente. La diferencia de expresión en el eje dorso-ventral fue estudiada para 13 de estos 15 transcritos en X. tropicalis y para los homólogos identificados en X. laevis. El análisis mediante RT-PCR y/o hibridación in situ confirmó la diferencia para 9 de los 13 transcritos enX tropicalis y para los 7 transcritos identificados en X laevis, Para dos transcritos nuevos de expresión dorsal, DVI2 y DV18, se realizaron estudios de pérdida de función en X. laevis utilizando morfolinos, oligómeros anti-sentido diseñados específicamente para bloquear la traducción de transcritos. DV12 y DVI8 son transcritos altamente conservados en animales y no se ha descrito la función de ninguno de ellos. Estos estudios indicaron que ambos transcritos son necesarios para la diferenciación neuronal debido a que la inyección de morfolinos produce la pérdida de marcadores neuronales como Ntubulina, engrailed-2 y krox-20. Los ensayos de ganancia de función de DV12 y DV/8 mostraron que ambos transcritos inducen la expresión ectópica de N-tubulina, resultados consistentes con su probable función en neurogénesis. Otro transcrito estudiado en profundidad corresponde a DV05, derivado de un elemento transponible de la superfamilia de transposones de DNA Tcl, para el cual no se ha encontrado homólogo en X laevis. De forma interesante, se observó que ambas hebras (sentido y antisentido) de este transcrito se expresan asimétricamente en el eje dorso-ventral. Este gen tiene 116 ocurrencias en el genorna de X tropicalis y la mayoría de ellos corresponde a copias inactivas por mutaciones. El análisis de clones de cDNA de DV05 mostró que ninguno de los clones codificaría una transposasa funcional. Se ha propuesto que transcritos derivados de elementos transponibles generan siRNAs que participarían en el silenciamiento de transposones y/o regulación de la cromatina. Futuros ensayos funcionales son necesarios para determinar su participación en el desarrollo embrionario. En conclusión, esta Tesis generó una lista de transcritos con diferencia de expresión no descrita en el eje dorso-ventral de Xenopus. Los estudios funcionales para dos de ellos son consistentes con la diferencia de expresión detectada mediante SAGE y sugieren que la lista de transcritos obtenida incluye nuevos genes involucrados en el establecimiento del patrón dorso-ventral de los vertebrados.

Similares en LA Referencia