Participación de proteínas-g en el proceso de maduración inducido por progesterona en ovocitos de xenopus laevis

La hormona progesterona induce el proceso de maduración meiótica del ovocito de Xenopus laevis a través de un mecanismo de acción no genómico, el cual se caracteriza por ser un evento rápido en el tiempo y que involucra la inhibición del sistema efector adenilil ciclasa (AC). La participación de pro...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Romo-Marty, Ximena Carolina
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2005
País:Chile
Idioma:español
OAI Identifier:oai:repositorio.anid.cl:10533/179545
Acceso en línea:http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/
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description La hormona progesterona induce el proceso de maduración meiótica del ovocito de Xenopus laevis a través de un mecanismo de acción no genómico, el cual se caracteriza por ser un evento rápido en el tiempo y que involucra la inhibición del sistema efector adenilil ciclasa (AC). La participación de proteínas G en el proceso de maduración se basa principalmente en el hecho que el efecto inhibidor del esteroide es dependiente de GTP. Sin embargo, hasta el momento la identidad de la proteína G involucrada en este proceso no ha sido definida de manera directa, aunque posiblemente Gas sería el modulador involucrado. Recientemente se ha postulado que el heterodímero G3y de la proteína G también estaría directamente involucrado en el control del proceso de maduración, manteniendo activa la AC en forma constitutiva y por lo tanto bloqueando la entrada del ovocito a la transición G2/M del ciclo celular. Ha sido propuesto que progesterona actúa interfiriendo con la activación de la AC por Gas y Gy. En este trabajo de tesis se estudió cómo los cambios en los niveles de Gas afectan el proceso de maduración inducido por progesterona. Se encontró que la sobre expresión en el ovocito de la Gas silvestre de X. laevis y de la mutante constitutiva mente activa Ga5QL, bloquearon la maduración inducida por progesterona, siendo más efectiva la mutante GasQL que la forma silvestre. Por otro lado, la depleción de la Gas endógena, utilizándose oligonucleótidos sin sentido, causó maduración espontánea del ovocito y activación de la vía MARK. Estos resultados indican claramente que la presencia de Gas en el ovocito es necesaria para mantener el ovocito detenido en la interfase G2/M. Para analizar en mayor detalle la participación de Gas, se estudió el efecto de dos mutantes dominantes negativas para Gas. Se encontró que la mutante dGas acelera el proceso de maduración inducido por progesterona, y la mutante DGas causa maduración espontánea, sin embargo la coinyección de la subunidad Gftj revierte el efecto inductor de la maduración de la dominante negativa, lo que indicaría que la dominante negativa estaría actuando como proteína secuestradora de Gí37 y no sería capaz de desacoplar a Gas endógena de un receptor activado. La sobre-expresión de receptores del tipo GPCR como el 32AR y los receptores muscarinícos M4 y M5, causaron una inhibición de la activación de la vía MAPK por progesterona. El efecto observado se debería a que estos receptores al ser activados por sus respectivos ligandos inducen la liberación de G37 desde su respectiva Gu, la cual junto con Gas-GTP, activan la AC. Para corroborar la participación de G3y en el proceso de maduración, se expresaron diferentes subunidades Ga, con el objeto de secuestrar Gy e inducir maduración. Se observó que Gcto induce el proceso de maduración, indicando que es un fuerte secuestrador de Gy. También se investigó el mecanismo por el cual progesterona podría estar afectando el intercambio GDP/GTP por parte de la proteína Gas. No se observó ningún efecto del esteroide sobre la capacidad de Gas de intercambiar nucleótido, incluso en un sistema activado por el ligando isoproterenol, indicando que progesterona no afecta directamente la función GEF del complejo hormonareceptor. Al respecto, se clonó desde ovocitos el cADN codificante para una proteína denominada sinembrina (xSin) y que posee actividad GEF. Se observó que la microinyección del ARNm para xSin bloqueó la maduración y su depleción por el uso de siARN aceleró el proceso, indicando la participación de esta proteína en la maduración meiótica. Basados en los resultados obtenidos en esta tesis se propone que Gas y G3y estarían participando en la mantención del estado inmaduro del ovocito, activando la AC y elevando los niveles de cAMP. Nosotros proponemos que el activador endógeno de Gas sería la proteína sinembrina, a través de su actividad GEF. Progesterona, a través de un mecanismo aún desconocido, interferiría con la función de sinembrina con la consecuente caída en los niveles de cAMP y maduración del ovocito.
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Sin embargo, hasta el momento la identidad de la proteína G involucrada en este proceso no ha sido definida de manera directa, aunque posiblemente Gas sería el modulador involucrado. Recientemente se ha postulado que el heterodímero G3y de la proteína G también estaría directamente involucrado en el control del proceso de maduración, manteniendo activa la AC en forma constitutiva y por lo tanto bloqueando la entrada del ovocito a la transición G2/M del ciclo celular. Ha sido propuesto que progesterona actúa interfiriendo con la activación de la AC por Gas y Gy. En este trabajo de tesis se estudió cómo los cambios en los niveles de Gas afectan el proceso de maduración inducido por progesterona. Se encontró que la sobre expresión en el ovocito de la Gas silvestre de X. laevis y de la mutante constitutiva mente activa Ga5QL, bloquearon la maduración inducida por progesterona, siendo más efectiva la mutante GasQL que la forma silvestre. 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La sobre-expresión de receptores del tipo GPCR como el 32AR y los receptores muscarinícos M4 y M5, causaron una inhibición de la activación de la vía MAPK por progesterona. El efecto observado se debería a que estos receptores al ser activados por sus respectivos ligandos inducen la liberación de G37 desde su respectiva Gu, la cual junto con Gas-GTP, activan la AC. Para corroborar la participación de G3y en el proceso de maduración, se expresaron diferentes subunidades Ga, con el objeto de secuestrar Gy e inducir maduración. Se observó que Gcto induce el proceso de maduración, indicando que es un fuerte secuestrador de Gy. También se investigó el mecanismo por el cual progesterona podría estar afectando el intercambio GDP/GTP por parte de la proteína Gas. No se observó ningún efecto del esteroide sobre la capacidad de Gas de intercambiar nucleótido, incluso en un sistema activado por el ligando isoproterenol, indicando que progesterona no afecta directamente la función GEF del complejo hormonareceptor. Al respecto, se clonó desde ovocitos el cADN codificante para una proteína denominada sinembrina (xSin) y que posee actividad GEF. Se observó que la microinyección del ARNm para xSin bloqueó la maduración y su depleción por el uso de siARN aceleró el proceso, indicando la participación de esta proteína en la maduración meiótica. Basados en los resultados obtenidos en esta tesis se propone que Gas y G3y estarían participando en la mantención del estado inmaduro del ovocito, activando la AC y elevando los niveles de cAMP. Nosotros proponemos que el activador endógeno de Gas sería la proteína sinembrina, a través de su actividad GEF. Progesterona, a través de un mecanismo aún desconocido, interferiría con la función de sinembrina con la consecuente caída en los niveles de cAMP y maduración del ovocito.PFCHA-BecasDoctor en Ciencias Biológicas Area Biología Celular y Molecular156p.PFCHA-BecasTERMINADAhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/102186https://hdl.handle.net/10533/179545spainstname: Conicytreponame: Repositorio Digital RI2.0instname: Conicytreponame: Repositorio Digital RI2.0handle/10533/108040info:eu-repo/grantAgreement/PFCHA-Becas/302035info:eu-repo/semantics/dataset/hdl.handle.net/10533/93488Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 Chileinfo:eu-repo/semantics/openAccessParticipación de proteínas-g en el proceso de maduración inducido por progesterona en ovocitos de xenopus laevisTesis Doctoradoinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionTesisTesishttps://hdl.handle.net/10533/179545PFCHA-Becasf1c7c7e8-bdd7-4b67-a82d-5f7f3efac1fcvirtual::65955-1f1c7c7e8-bdd7-4b67-a82d-5f7f3efac1fcvirtual::65955-1ORIGINALROMO_XIMENA_0575D.pdfapplication/pdf37331117https://repositorio.anid.cl/bitstreams/69de09d8-dcc2-4006-96a8-d3e5720e3c5e/download9e880d80044567a31fda9cba0d5c2b48MD51TEXTROMO_XIMENA_0575D.pdf.txtExtracted texttext/plain212608https://repositorio.anid.cl/bitstreams/32cb6c89-43c0-4173-b503-d14cb25aece0/downloadb2f9683d288b5f825baa59dcc0892749MD52THUMBNAILROMO_XIMENA_0575D.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg1856https://repositorio.anid.cl/bitstreams/22f17d9a-528d-40ee-a9ce-3eacc4cd1bfc/downloadf7f5fc8cf9764f8298d8562d5fc7b9f5MD5310533/179545oai:repositorio.anid.cl:10533/1795452023-07-24 18:06:54.147https://repositorio.anid.clRepositorio ANIDaletelier@anid.cl
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