Participación de los factores transcripcionales Fnr y ArcA en la dinámica estructural dependiente de oxígeno del lipopolisacárido y su impacto sobre la virulencia de Salmonella enterica serovar Enteritidis
El lipopolisacárido (LPS) es el mayor componente de la superficie de bacterias Gram negativo y un importante mediador de las interacciones con el hospedero durante el ciclo infeccioso de bacterias patógenas. Tres dominios componen el LPS: el antígeno O (AgO), el core u oligosacárido central y el líp...
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2019 |
| País: | Chile |
| OAI Identifier: | oai:repositorio.anid.cl:10533/237743 |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/10533/237743 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Ciencias Naturales Otras Ciencias Naturales |
| Sumario: | El lipopolisacárido (LPS) es el mayor componente de la superficie de bacterias Gram negativo y un importante mediador de las interacciones con el hospedero durante el ciclo infeccioso de bacterias patógenas. Tres dominios componen el LPS: el antígeno O (AgO), el core u oligosacárido central y el lípido A. Todos los dominios del LPS pueden sufrir modificaciones en respuesta a estímulos ambientales, sin embargo las modificaciones realizadas sobre el lípido A son las mayormente estudiadas debido a su impacto sobre la virulencia de bacterias patógenas. Por ejemplo, se ha establecido que estas modificaciones pueden aumentar la resistencia a péptidos catiónicos antimicrobianos producidos por el hospedero y ayudan a evadir el reconocimiento del lípido A por los receptores TLR4. Durante su ciclo infeccioso, Salmonella se ve enfrentada a distintas condiciones ambientales a las cuales se debe adaptar mediante la regulación de la expresión de sus genes. Se ha evidenciado que en condiciones que simulan el interior de la vacuola contenedora de Salmonella, esta bacteria altera la expresión de genes involucrados en la modificación del lípido A con el objetivo incrementar su supervivencia dentro de este compartimiento. No obstante, la regulación de la expresión de estos genes bajo otras condiciones que enfrenta Salmonella durante su ciclo infeccioso aún no ha sido estudiada. Dentro de este contexto, en el lumen intestinal Salmonella se debe adaptar a una disminución progresiva en la tensión de oxígeno. Para eso, esta bacteria cuenta con varios sensores que reconocen estos estímulos ambientales, los que a su vez activan a los reguladores de respuesta encargados de modificar la expresión de genes para adaptarse a esta condición. Tal es el caso del regulador global de respuesta Fnr y del sistema de dos componentes ArcA/ArcB. Previamente, en nuestro laboratorio se demostró por análisis de qRT-PCR que varios genes involucrados en la modificación del lípido A son regulados por la disponibilidad de oxígeno en forma dependiente de Fnr. En concordancia con los antecedentes expuestos, este trabajo de tesis tuvo como objetivo principal determinar el rol de los factores transcripcionales Fnr y ArcA sobre los cambios en la estructura del LPS y el lípido A en respuesta a las variaciones en la disponibilidad de oxígeno y evaluar el efecto de esta respuesta sobre la virulencia de S. Enteritidis en Danio rerio (pez cebra). Más específicamente, se evaluó el efecto de la regulación oxígeno-dependiente ejercida por ArcA sobre la expresión de los genes lpxO y pagP. El gen lpxO codifica la dioxigenasa LpxO que hidroxila una cadena secundaria del lípido A de Salmonella, mientras que pagP codifica la palmitoil transferasa PagP, encargada de la acilación secundaria del lípido A. Estas modificaciones son relevantes dentro del ciclo infeccioso de Salmonella, ya que disminuyen la capacidad del lípido A de activar la respuesta inflamatoria en macrófagos. Sumado a lo anterior, se escogió estudiar estas modificaciones debido a que la expresión de los genes lpxO y pagP es regulada por la disponibilidad de oxígeno y, además, las especies hidroxiladas y/o palmitoiladas de lípido A ya habían sido identificadas en S. Enteritidis. En este trabajo de tesis se determinó, mediante la construcción de fusiones transcripcionales, que ArcA reprime la expresión de los genes lpxO y pagP en condiciones anaeróbicas de crecimiento, mientras que Fnr también reprime la expresión de lpxO bajo las mismas condiciones. En el caso de la regulación ejercida por ArcA, se demostró que esta regulación es directa ya que se predijo la existencia de tres sitios de unión a ArcA (ABS) en el promotor de estos genes, los cuales tienen la capacidad de unirse in vitro a ArcA fosforilada (ArcA-P). Además, mediante ensayos de cambio en la movilidad electroforética, se logró identificar los ABS principalmente responsables de esta interacción. La mutación puntual de estos ABS redujo la afinidad del promotor de lpxO por ArcA-P in vitro. Esta es la primera evidencia que demuestra que ArcA regula directamente la expresión de genes involucrados en la modificación del lípido A de Salmonella en respuesta a la disponibilidad de oxígeno. Con el objetivo de evaluar el impacto de esta regulación sobre la producción de LPS y la virulencia de S. Enteritidis, se construyeron mutantes por deleción génica de lpxO y pagP y además, se generaron mutantes regulatorias de los mismos genes que presentaban mutaciones puntuales en los ABS de sus promotores. Si bien se construyeron las mutantes regulatorias, éstas no pudieron ser utilizadas por diferentes razones. Por un lado, por razones que desconocemos la mutante regulatoria del gen lpxO no presentaba AgO, mientras que la mutante regulatoria del gen pagP presentaba inactivación de su promotor. Independiente a los problemas mencionados, se realizaron ensayos de infección por inmersión estática en pez cebra con cepas de S. Enteritidis. Así, se demostró que una mutante que carece del gen pagP presenta un fenotipo atenuado de virulencia cuando se compara con la cepa silvestre. Por otra parte, los resultados también indican que una mutante carente del gen lpxO presenta un fenotipo más virulento en comparación con la cepa silvestre. Para nuestro conocimiento, esta es la primera vez que se evalúa el impacto de las modificaciones del lípido A sobre la virulencia de Salmonella en Danio rerio. |
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