Culturas primárias de células epiteliais e glandulares uterinas como modelo para estudo da fisiologia uterina
INTRODUÇÃO: O estudo da biologia uterina é vital para a compreensão de suas relações com o embrião e suas interações com as células trofoblásticas. Apesar dos numerosas estudos acumulados na literatura, o conhecimento obtido até o momento ainda não é suficiente para a compreensão das falhas de impla...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis de maestría |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2024 |
| País: | Brasil |
| Institución: | Universidade de São Paulo (USP) |
| Repositorio: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
| Idioma: | portugués |
| OAI Identifier: | oai:teses.usp.br:tde-09052025-093318 |
| Acceso en línea: | https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42134/tde-09052025-093318/ |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | cultivo de células primárias endometriais culture of primary endometrial cells endométrio endometrium epitélio glandular uterino extracellular matrix matriz extracelular uterine glandular epithelium |
| Sumario: | INTRODUÇÃO: O estudo da biologia uterina é vital para a compreensão de suas relações com o embrião e suas interações com as células trofoblásticas. Apesar dos numerosas estudos acumulados na literatura, o conhecimento obtido até o momento ainda não é suficiente para a compreensão das falhas de implantação, um problema recorrente e muito frequente. OBJETIVOS: Neste estudo pretendemos caracterizar um modelo de cultura primária de células endometriais em sistemas tradicionais 2D ou sobre uma matriz suporte. Além disso, investigaremos também o papel da gonadotrofina coriônica (hCG), usualmente secretada pelas células trofoblásticas durante a implantação embrionária, na manutenção destas células em cultura. MÉTODOS: A partir do protocolo clínico para a análise de fatores uterinos que possam inviabilizar a transferência de embrião em mulheres em tratamento de infertilidade, obtivemos um fragmento (parcial) das biópsias endometriais realizadas (n=6). Estes fragmentos foram submetidos a digestão enzimática com colagenase II (1 mg/mL) e DNAse I (0,1 mg/mL) e em seguida filtrados em filtro de 70 µm para a retenção das glândulas endometriais. Parte das glândulas foi utilizada para cultura sobre matriz-suporte e parte foi novamente dissociadas com tripsina 0,25% em EDTA. As células assim obtidas foram cultivadas para caracterização e ensaios com hCG. Para a cultura das células utilizou-se o meio DMEM/F12 suplementado (10% soro bovino fetal, antibióticos (50 U/mL penicilina/ 0,05 mg/mL estreptomicina) e uma mistura de 300 pg/mL β-estradiol e 20 ng/mL progesterona). As células foram mantidas a 37oC em atmosfera úmida contendo 5% de CO2, por até 72 horas e então expandidas ou caracterizadas. A caracterização foi realizada pela localização imunohistoquímica de biomarcadores característicos dos diferentes tipos celulares (glicodelina e citoqueratina para células epiteliais e vimentina para células de origem mesenquimal), o que foi quantificado em relação ao total de células/10 campos microscópicos (200x). Células tratadas com gonadotrofina coriônica (5 UI/mL) ou não (controle) foram também submetidas a ensaios para avaliação de proliferação (BrdU) e morte celular (LDH). O ambiente 3D foi construído em um sistema Transwell, utilizando-se uma mistura de fibronectina-colágeno V-colágeno I-colágeno III nas concentrações 0,04 µg/mL, 0,04 µg/mL, 320 µg/mL e 320 µg/mL, respectivamente. Sobre essa matriz foram cultivados fragmentos de glândulas uterinas ou células isoladas obtidas a partir da digestão dos fragmentos glandulares. Os sistemas de cocultivo foram fixados em 2% paraformaldeído em 0,1 M PBS, pH 7,2, retirados do transwell e processados rotineiramente para inclusão em Paraplast. Cortes de 5 µm foram corados pela Hematoxilina e Eosina para análises morfológicas em microscopia de luz convencional. RESULTADOS: As células epiteliais isoladas e cultivadas em sistemas 2D assumiram morfologias poligonais diversas, sendo que era comum a presença de aglomerados celulares e células dispersas a partir deles, formando quase uma monocamada. A caracterização por imunofluorescência verificou a maioria de células positivas para citoqueratina e glicodelina A, caracterizando a cultura como mista mas com predomínio de células epiteliais. Os ensaios de LDH não mostraram diferenças significativas (n=3, p>0.05) entre células epiteliais cultivadas por até 72 h, indicando que as células se mantiveram viáveis ao longo do tempo experimental. No entanto, a análise da proliferação celular mostrou maior incorporação de bromodeoxiuridina nas primeiras 24 h de cultivo, e incorporação muito reduzida nos tempos seguintes estudados. A presença de gonadotrofina coriônica, entretanto alterou, aumentando significativamente essa incorporação após 48 e 72 h de cultivo (p<0,005). As glândulas cultivadas sobre matriz-suporte apresentaram morfologia semelhante e saudável quando analisadas sob microscopia de luz. CONCLUSÕES: Este estudo mostrou que utilizando um protocolo relativamente simples é possível obter células endometriais saudáveis que podem ser utilizadas para diferentes fins científicos. Além disso, a alteração nas atividades proliferativas destas células na presença de gonadotrofina coriônica também nos mostra que esse pode ser um modelo muito útil para o estudo direto ou via fatores embrionários da interface materno-fetal. Fragmentos glandulares em matriz-suporte mostraram também a possibilidade de manutenção do binômio epitélio-estroma endometrial abrindo a possibilidade para estudos em que a transdução de sinais via epitélio para o estroma são de crucial importância para a sucesso da implantação embrionária. |
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