Desenvolvimento de um sistema induzível de expressão mediado pela Cre-recombinase para a caracterização do domínio C-terminal da proteína RAD9 de Leishmania major
O desenvolvimento de novas ferramentas para manipulação genética é necessário para um melhor entendimento da biologia de protozoários que causam doenças sérias e negligenciadas. Neste contexto, apresentamos uma nova aplicação do sistema Cre recombinase em Leishmania major, utilizado para a expressão...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis de maestría |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2017 |
| País: | Brasil |
| Institución: | Universidade de São Paulo (USP) |
| Repositorio: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
| Idioma: | portugués |
| OAI Identifier: | oai:teses.usp.br:tde-25042018-162053 |
| Acceso en línea: | http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-25042018-162053/ |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Cre-recombinase Leishmania Rad9 |
| Sumario: | O desenvolvimento de novas ferramentas para manipulação genética é necessário para um melhor entendimento da biologia de protozoários que causam doenças sérias e negligenciadas. Neste contexto, apresentamos uma nova aplicação do sistema Cre recombinase em Leishmania major, utilizado para a expressão condicional de genes de interesse. Como prova de conceito demonstramos por ensaios de PCR, western blotting e imunofluorescência que o gene da Proteína Fluorescente Verde (Green Fluorescent Protein, GFP) é condicionalmente expresso em função do tempo e dose de rapamicina necessários para a ativação da recombinase. A aplicação do sistema diCre em L. major é feita com o estudo da proteína Rad9, que participa na sinalização e resposta a danos ao DNA. A Rad9 de L. major possui um domínio C-terminal desestruturado, que no homólogo humano não é essencial para a formação do complexo 911 (Rad9-Hus1-Rad1), mas possui sítios de fosforilação importantes para a cascata de sinalização que mantém a integridade do DNA. Usando predições da estrutura de Rad9, a proteína foi dividida em domínios e foram geradas linhagens que expressam, condicionalmente, versões truncadas de Rad9. Por análises de PCR, western blotting, citometria de fluxo e imunofluorescência, acessamos alguns dos papeis que o domínio C-terminal de Rad9 pode desempenhar em L. major. |
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