Terapia gênica in vivo com lentivetor para redução da fibrose muscular via sTβRII induzido por NF-κB.
Lesões musculares graves geram um microambiente inflamatório persistente, no qual a citocina TGF-β1 se liga ao receptor TβRII no sarcolema, ativando genes fibróticos e atróficos e inibindo genes miogênicos, o que prejudica a regeneração muscular. Este estudo desenvolveu dois vetores lentivirais: um...
| Author: | |
|---|---|
| Format: | master thesis |
| Status: | Published version |
| Publication Date: | 2025 |
| Country: | Brasil |
| Institution: | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Repository: | Repositório Institucional da UNIFESP |
| Language: | Portuguese |
| OAI Identifier: | oai:repositorio.unifesp.br:11600/74250 |
| Online Access: | https://hdl.handle.net/11600/74250 |
| Access Level: | Open access |
| Keyword: | Lesão muscular NF-kB Lentivetor Fibrose TβRII Não se aplica |
| Summary: | Lesões musculares graves geram um microambiente inflamatório persistente, no qual a citocina TGF-β1 se liga ao receptor TβRII no sarcolema, ativando genes fibróticos e atróficos e inibindo genes miogênicos, o que prejudica a regeneração muscular. Este estudo desenvolveu dois vetores lentivirais: um terapêutico, contendo o receptor solúvel de TGF-β1 (Lv_NF-κB_sTβRII), e um controle (Lv_NF-κB_Luci), ambos regulados pelo promotor induzível por NF-κB. Os vetores foram desenhados, clonados e testados in vitro em células C2C12 lesionadas com cloreto de bário (BaCl₂), mostrando aumento de sTβRII, maior densidade de MHC-emb e redução de Pax7 no grupo sTβRII (p < 0,05). O secretoma de células-tronco mesenquimais humanas (MSCs) editadas para superexpressar sTβRII foi produzido, e sua eficiência de transfecção foi confirmada, mostrando redução significativa na proliferação de progenitores fibroadipogênicos (FAPs) humanos em relação ao controle, após 24 horas de tratamento. Nos ensaios in vivo, camundongos foram divididos em grupos Controle, Lesão e Lesão/Tratamento, sendo lesionados no músculo tibial anterior por contusão (animais Contusão) ou laceração (animais Laceração). O vetor Lv_NF-κB_sTβRII foi aplicado no grupo Lesão/Tratamento (40 µL/pata, 3,15 × 10⁵ TU/mL). Foram realizadas análises funcionais (teste de esteira e escalada com sobrecarga), ELISA de TGF-β1 plasmático, RT-qPCR para avaliar inflamação, fibrose, diferenciação miogênica e expressão de sTβRII, além de análises histológicas com Hematoxilina-Eosina e Picrosirius Red. Os dados foram analisados com testes t independente, ANOVA de uma via, Friedman, Kruskal-Wallis e Mann-Whitney no GraphPad Prism 10.0, com intervalo de confiança de 95%. Nos animais Contusão, o grupo Lesão exibiu o menor desempenho na esteira ao longo de 30 dias (+39,02%) e a menor média de carga suportada na escada (28,50 g), enquanto o grupo Lesão/Tratamento mostrou melhor desempenho na esteira (+88,76%) e maior carga suportada (31 g). Nos animais Laceração, o grupo Lesão apresentou o menor desempenho na esteira (-44,68% aos 15 dias, -53,80% aos 30 dias), enquanto o grupo Lesão/Tratamento teve melhor desempenho (+14,59% aos 15 dias, -18,83% aos 30 dias). Histologicamente, o grupo Lesão/Tratamento apresentou redução de edema e inflamação aos 4 dias, e aos 34 dias mostrou menor densidade de colágeno e organização tecidual mais homogênea (Picrosirius Red), além de menos fibrose e infiltrado inflamatório (HE), embora sem alterações estruturais marcantes (laceração e contusão). A RT-qPCR dos animais Contusão revelou aumento significativo na expressão de NF-κB, Smad3, Pax7 e sTβRII e redução significativa em Smad2, Col1a1 aos 4 dias; além do aumento significativo de IL-6, Smad7, Pax7, MyoD, MyoG e sTβRII e a redução de NF-κB aos 34 dias, no grupo Lesão/Tratamento. O ELISA de TGF-β1 indicou expressão localizada. Assim, o vetor Lv_NF-κB_sTβRII modulou a expressão de sTβRII, atenuou a fibrose pelo sequestro de TGF-β1, promoveu a regeneração muscular e melhorou o desempenho funcional dos animais Contusão e Laceração, evidenciando seu potencial terapêutico, embora a dose utilizada sugira a necessidade de otimização para resultados mais robustos. |
|---|