Estudo genético da interação entre FtsZ e o modulador de divisão ZapA em Bacillus subtilis
A citocinese bacteriana é controlada por diversas proteínas que se agrupam em um complexo chamado divisomo. O cerne do divisomo é constituído por FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica, que se auto-associa formando uma estrutura chamada anel Z. O anel Z serve como arcabouço e recruta div...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis de maestría |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2009 |
| País: | Brasil |
| Institución: | Universidade de São Paulo (USP) |
| Repositorio: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
| Idioma: | portugués |
| OAI Identifier: | oai:teses.usp.br:tde-03082009-090556 |
| Acceso en línea: | http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-03082009-090556/ |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Bacillus subtilis Anel Z Biologia molecular Divisão celular Divisome Divisomo FtsZ Genética bioquímica Moduladores Modulators Molecular biology Z ring ZapA |
| Sumario: | A citocinese bacteriana é controlada por diversas proteínas que se agrupam em um complexo chamado divisomo. O cerne do divisomo é constituído por FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica, que se auto-associa formando uma estrutura chamada anel Z. O anel Z serve como arcabouço e recruta diversas outras proteínas componentes do divisomo para o sítio onde o septo será sintetizado na célula. A formação do anel Z é modulada por proteínas que se ligam diretamente a FtsZ e regulam a sua auto-associação, tanto induzindo como inibindo a sua polimerização. Apesar de muitos destes moduladores de FtsZ já serem conhecidos, muito pouco se sabe sobre o mecanismo pelo qual eles controlam a estruturação do anel Z in vivo. O objetivo do presente trabalho foi estudar a interação entre FtsZ e um modulador de divisão, a proteína ZapA, da bactéria gram-positiva Bacillus subtilis. Para isso construímos uma biblioteca de mutantes de ftsZ por \"Error Prone PCR\", com aproximadamente 1 substituição por cópia de ftsZ e contendo um total de 1x105 clones. A partir dessa biblioteca, utilizamos duas triagens genéticas para identificar mutantes incapazes de interagir com ZapA. Na primeira estratégia, selecionamos 12 mutantes de FtsZ resistentes à superexpressão de uma forma tóxica de ZapA, que bloqueia a divisão, causando filamentação e morte das células. Surpreendentemente, apesar destes mutantes serem insensíveis ao efeito de ZapA, ensaios citológicos mostraram que nenhum deles perdeu a interação com ZapA. Como as mutações foram mapeadas nas vizinhanças do sítio catalítico e de polimerização de FtsZ, e como a maioria delas confere resistência cruzada aos efeitos de outros moduladores de FtsZ, suspeitamos que elas afetassem a estabilidade do polímero de FtsZ e, consequentemente, o comportamento do anel Z. Essas suspeitas foram confirmadas em ensaios de FRAP e cálculos de proporção de FtsZ no anel Z, indicando que os mutantes formam um anel Z mais estável que o normal. Como não obtivemos mutantes que perderam a interação com ZapA na primeira triagem, aplicamos a biblioteca em uma segunda estratégia de triagem genética, procurando um mutante de FtsZ que voltasse a interagir com um mutante de ZapA que não se liga mais a FtsZ (ZapAN62A). Esta estratégia de ganho de função identificou um candidato, FtsZE91V , que, tanto por critérios genéticos como citológicos, voltou a interagir com ZapAN62A. Apesar do mutante FtsZE91V mostrar-se capaz de restaurar a interação com ZapAN62A, ele não afetou a interação com ZapA selvagem, segundo nossos ensaios de microscopia de fluorescência e viabilidade. O mutante FtsZE91V, mapeia na hélice H3 de FtsZ. Esta hélice está exposta na superfície de FtsZ (compõe um dos lados da molécula de FtsZ) de uma maneira compatível com a idéia de que ela seria importante para interações laterais entre polímeros de FtsZ. Nossos resultados apontam, portanto, que a hélice H3 deve ser o sítio de interação para ZapA em FtsZ. |
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