Conjugação e validação de controle isotípico IgG1-FITC para uso em citometria de fluxo
Em meados da década de 50 iniciou-se o desenvolvimento da citometria de fluxo, tecnologia que permite verificar características físico-químicas de células ou partículas suspensas em meio fluido. Esta tecnologia utiliza anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos como ferramenta de investigação...
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| Tipo de documento: | artigo |
| Estado: | Versão publicada |
| Data de publicação: | 2007 |
| País: | Brasil |
| Recursos: | Universidade Estadual Paulista (UNESP) |
| Repositório: | Repositório Institucional da UNESP |
| Idioma: | português |
| OAI Identifier: | oai:repositorio.unesp.br:11449/13504 |
| Acesso em linha: | http://dx.doi.org/10.1590/S1516-84842007000400008 http://hdl.handle.net/11449/13504 |
| Access Level: | Acceso aberto |
| Palavra-chave: | Controle isotípico citometria de fluxo anticorpo monoclonal isotiocianato de fluoresceína (FITC) Isotype control flow cytometry monoclonal antibody fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Resumo: | Em meados da década de 50 iniciou-se o desenvolvimento da citometria de fluxo, tecnologia que permite verificar características físico-químicas de células ou partículas suspensas em meio fluido. Esta tecnologia utiliza anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos como ferramenta de investigação em diversas análises e necessita de controles isotípicos para definição da região negativa (background). Estes controles são constituídos por imunoglobulinas de mesmo isotipo e fluorocromo dos anticorpos testes, sendo o isotiocianato de fluoresceína (FITC) o marcador fluorescente mais utilizado na conjugação de anticorpos. Os controles isotípicos têm como função definir a fluorescência inespecífica (células negativas) e as regiões fluorescentes (células positivas). No presente estudo foi selecionado anticorpo monoclonal murino (AcMm) dirigido contra antígeno eritrocitário canino, produzido no Laboratório de Anticorpos Monoclonais do Hemocentro de Botucatu, o qual reage positivamente com hemácias de cães, mas nunca com leucócitos humanos, tendo, portanto, potencial utilidade como controle negativo em citometria de fluxo. A purificação do AcMm da subclasse IgG1 foi feita por cromatografia de afinidade em Proteína-A Sepharose, e o controle da purificação realizado por eletroforese em géis de ágarose e poliacrilamida (SDS-PAGE). A imunoglobulina purificada foi conjugada ao FITC e filtrado em coluna de Sephadex G-25 para separação das proteínas marcadas e não-marcadas. O AcMm conjugado foi testado contra hemácias de cães, e o êxito da conjugação comprovado por testes de fluorescência, sendo a mediana de positividade de 94,70. Frente a leucócitos humanos a mediana de positividade foi 0,03 contra 0,50 dos reagentes comerciais. Os testes estatísticos não-paramétricos de Wilcoxon e correlação de Spearman comprovaram a eficiência e validam o controle isotípico produzido em comparação aos reagentes comerciais testados. |
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