Generación de células madre pluripotentes inducidas y estudio de la regulación de la expresión del gen Sod2 en células madre pluripotentes

Las células madre embrionarias (CME) son células derivadas del macizo celularinterno del blastocisto de mamíferos. Poseen la capacidad de auto-renovarseindefinidamente en cultivo en condiciones apropiadas mientras que, ante los estímulosadecuados, pueden dar origen a células de las tres capas germin...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Solari, Claudia María
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2015
País:Argentina
Institución:Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Repositorio:Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Idioma:español
OAI Identifier:tesis:tesis_n5712_Solari
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5712_Solari
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:CELULAS MADRE EMBRIONARIAS
CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS
AUTO-RENOVACION
PLURIPOTENCIA
REGULACION GENICA
ESTRES OXIDATIVO
SUPEROXIDO DISMUTASA
EMBRYONIC STEM CELLS
INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS
SELF-RENEWAL
PLURIPOTENCY
GENE REGULATION
OXIDATIVE STRESS
SUPEROXIDE DISMUTASE
Descripción
Sumario:Las células madre embrionarias (CME) son células derivadas del macizo celularinterno del blastocisto de mamíferos. Poseen la capacidad de auto-renovarseindefinidamente en cultivo en condiciones apropiadas mientras que, ante los estímulosadecuados, pueden dar origen a células de las tres capas germinales, propiedadconocida como pluripotencia. En la última década ha sido posible reprogramar célulasterminalmente diferenciadas obteniendo así las denominadas células madrepluripotentes (CMP) inducidas (CMPI), que presentan características similares a las CME, como el perfil de expresión génica, las modificaciones epigenéticas, y suspropiedades fundamentales, auto-renovación y pluripotencia. Por esta razón y dadoque además presentan ciertas ventajas, las CMPI son consideradas posibles sustitutosde las CME para diferentes aplicaciones. En el área de la medicina regenerativa, laposibilidad de generar células específicas para grupos de pacientes disminuye el riesgode rechazo en terapias de trasplante. Por otra parte, a partir de estas células puedendesarrollarse modelos de enfermedades y evaluar fármacos en diferentes contextosgenómicos. A pesar del gran avance desde el establecimiento de las CMPI, suobtención y propagación aún es un área de gran interés. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue desarrollar CMPI, como modelocomplementario a las CME para estudiar diversos mecanismos moleculares relevantespara el mantenimiento de las propiedades fundamentales de estas células. Para tal fin,hemos generado CMPI mediante reprogramación de fibroblastos embrionarios deratón y comprobado que las líneas obtenidas son capaces de auto-renovarse y sonpluripotentes, evaluado tanto in vitro como in vivo. Una vez validadas, las utilizamoscomo sistema de estudio en distintos proyectos. En primer lugar, en base a resultadosobtenidos previamente en el laboratorio y a la semejanza de las CMPI con las CME,estudiamos si el medio condicionado por una línea celular de granulosa bovina quepermite el cultivo de CME, también proporcionaba un contexto favorable para las CMPI. Mediante la detección de la expresión de marcadores específicos y deprotocolos de diferenciación in vitro e in vivo, determinamos que las CMPI pueden serpropagadas en este medio condicionado, conservando sus propiedadesfundamentales. En una segunda parte de este trabajo nos centramos en el estudio de la regulaciónde genes relacionados con uno de los mecanismos que aseguran la estabilidadgenómica de las CMP, el sistema de defensa frente al estrés oxidativo. A pesar de queha sido reportado que la actividad antioxidante disminuye a lo largo de ladiferenciación, poco se sabe acerca de la regulación transcripcional de los genesinvolucrados. Dada la importancia de este sistema, nos propusimos estudiar suregulación a partir de la hipótesis de que algunos de estos genes podrían sermodulados por los factores de transcripción (FT) esenciales para la auto-renovación yla pluripotencia de las CMP. Estudiamos el perfil de expresión de genes seleccionados,tanto en líneas comerciales de CME como en las CMPI obtenidas. Si bien hallamosperfiles de expresión muy variados para la mayoría de los genes analizados,observamos que el gen de la superóxido dismutasa 2 (Sod2) fue reprimido durante elproceso de diferenciación, en todos los modelos estudiados. A continuaciónestudiamos su regulación mediante la modulación de la expresión de los FT. Ademásgeneramos construcciones reporteras y evaluamos la actividad del promotor de Sod2en ensayos de trans-activación. En conjunto, los resultados obtenidos a partir de lasdiferentes estrategias experimentales empleadas nos permitieron confirmar nuestrahipótesis, concluyendo que el gen de Sod2 es regulado por los factores fundamentalesen CMP. Esperamos que las herramientas generadas y los resultados obtenidos en estetrabajo contribuyan a la comprensión de los mecanismos moleculares relevantes en elmantenimiento de las propiedades fundamentales de las CMP, crítico para susaplicaciones futuras.

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