Catecolamina - beta alanil ligasa (cbal), enzima clave en el metabolismo de neurotransmisores en los insectos

En la presente Tesis se ha estudiado la enzima NBAD-sintetasa, responsable de lasíntesis de NBAD, el principal precursor de esclerotización de las cutículas marrones delos insectos. Se la caracterizó en detalle y se estudió su expresión en el ciclo de vida de C.capitata. El aporte principal ha sido,...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Pérez, Martín Mariano
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2004
País:Argentina
Institución:Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Repositorio:Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Idioma:español
OAI Identifier:tesis:tesis_n3736_Perez
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3736_Perez
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:CERATITIS CAPITATA
INSECTOS
METAMORFOSIS
ESCLEROTIZACION
AMINAS BIOGENICAS
CATECOLAMINA-BETA-ALANIL LIGASA (CBAL)
NBAD-SINTETASA
SISTEMA NERVIOSO
RESPUESTA INMUNE
MUTANTES MELANICOS
INSECTS
METAMORPHOSIS
SCLEROTIZATION
BIOGENIC AMINES
CATECHOLAMINE-BETA-ALANYL-LIGASE (CBAL)
NBAD-SYNTHASE
NERVOUS SYSTEM
IMMUNE RESPONSE
MELANIC MUTANTS
Descripción
Sumario:En la presente Tesis se ha estudiado la enzima NBAD-sintetasa, responsable de lasíntesis de NBAD, el principal precursor de esclerotización de las cutículas marrones delos insectos. Se la caracterizó en detalle y se estudió su expresión en el ciclo de vida de C.capitata. El aporte principal ha sido, justamente, el estudio en detalle de esta enzima. Anteriormente a esta Tesis, ésta era una enzima prácticamente desconocida. Si bien sehabía postulado que el NBAD era el principal precursor de esclerotización de lascutículas marrones de los insectos, excepto nuestro laboratorio, nadie había publicadonada sobre la enzima que lo sintetiza. Se determinó la expresión de la NBAD-sintetasa enla metamorfosis. Se la caracterizó y se demostró que la misma posee una ampliaespecificidad de sustratos. Se demostró por primera vez la actividad de esta enzima ensistema nervioso y respuesta inmune. Se clonó y secuenció por primera vez un mutantemelánico de D. melanogaster, carente de esta actividad enzimática. Por su amplíaespecificidad de sustratos hemos denominado a esta enzima como Catecolamina-B-alanilligasa (CBAL). Los principales resultados obtenidos son: -Se determinó el patrón de expresión de la enzima en el tejido epidérmico duranteel ciclo de vida de C. capítata. La actividad de esta enzima se detectó en momentos muyacotados del ciclo de vida, coincidiendo con los momentos en que los individuos necesitanesclerotizar sus cutículas. Esta actividad es dependiente de la hormona de la muda 20-OH-ecdisona. La actividad está ausente en el tegumento de las larvas, pues las mismas son decutícula blanda y no sufren el proceso de esclerotización. El primer momento durante elciclo de vida en que se detectó la actividad fue en las prepupas cuando se forma el pupario. Luego de varias horas la actividad fue indetectable hasta el estadío de adulto farado dondese volvió a registrar la actividad extendiéndose ésta hasta la emergencia del adulto. -Se descubrió y se dosó por primera vez in vitro la actividad NBAD-sintetasa entejido nervioso. Se estudió el patrón de expresión y se determinó que la actividad en estetejido es constante a lo largo del ciclo de vida. Incluso se detectó actividad en el “cerebro”de las larvas, hecho significativo puesto que en este estadío nunca se detectó esta actividaden la epidermis. En adultos se demostró que la actividad en el sistema nervioso permanece constante durante todo el estadío, mientras que en la epidermis, luego de las primeras 48horas, cuando ya ha finalizado el proceso de la esclerotización, no se detecta más laactividad. - Por primera vez se observó que la NBAD-sintetasa participa en la respuestainmune innata de los insectos. Esta actividad se manifiesta solamente cuando losindividuos son invadidos por un patógeno o cuando se produce una injuria en la cutícula. También se determinó la función antibacteriana del NBAD. - Se caracterizaron las diferentes actividades enzimáticas y se concluyó que todascorresponderían a una misma enzima. La misma mostró una amplia especificidad desustrato, siendo capaz de conjugar β-alanina con catecolaminas, indolaminas eimidoaminas. Por primera vez se logró sintetizar in vitro: NBANE, NBAOA; NBATA, NBASHT, NBAHA (carcinina) y NBATyr (sarcofagina). Debido a la amplia especificidadde sustrato que mostró, hemos denominado a esta enzima como “Catecolamina-β-alanilligasa” (CBAL). - Se estudiaron los mutantes melánicos niger de C. capitata y ebony de D.melanogaster. Se determinó que ambos mutantes son homólogos; los dos carecen de laactividad NBAD-sintetasa en epidermis (esclerotización y respuesta inmune) y en sistemanervioso. Ambos mutantes muestran deficiencias en el comportamiento. El estudio de losmutantes demostró que las proteínas responsables de las actividades enzimáticascorresponden a un único gen. - Se clonó y secuenció el gen ebony de D. melanogaster en la cepa salvaje y elmutante e4. Se demostró, mediante Northern blots, que el ARNm del mutante es de menortamaño que el de la cepa salvaje. Luego se secuenció y se comprobó que el gen delmutante posee una deleción de 447 pb en el primer exón. Además se observó que en elsitio de la deleción se insertaron 15 nucleótidos pertenecientes a una secuencia extraña, lacual fue analizada y arrojó homología con una secuencia perteneciente a un gen debaculovirus. Se analizó, además, la región promotora y se encontraron secuencias dereconocimiento para genes que responden a 20-OH-ecdisona, factores de transcripción queactúan en tejido epidérmico, tejido nervioso o en la respuesta inmune. - Se comenzó a estudiar preliminarmente la enzima NBAD-hidrolasa. La mismamostró un patrón de expresión diferente a la sintetasa. La expresión de esta enzima se registró durante todo el ciclo de vida. También se observó que se expresa en tejidonervioso. Esta enzima también mostró una amplia especificidad de sustrato, siendo capazde hidrolizar los diferentes productos que sintetiza la NBAD-sintetasa. Los resultados obtenidos han permitido poner en evidencia la actividad de laenzima CBAL durante el ciclo de vida de C. capitata y los procesos fisiológicos en los queinterviene, claves en la evolución de los insectos. También se abrió un nuevo panorama enel estudio del metabolismo de aminas biogénicas y se aportó información para conocer elmetabolismo de β-alanina en insectos.

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