Mecanismos de acción de RSUME sobre la función del supresor tumoral VHL y su impacto en el desarrollo del sindrome VHL asociados a la desregulación de HIF

Los factores HIF son heterodímeros compuestos por dos subunidades, y β. Mientras que los niveles de HIF-β son constitutivos, la estabilidad y actividad de las subunidades HIF-1α y HIF-2α están finamente reguladas por los niveles de O2: contienen un dominio de degradación dependiente de oxígeno (ODD)...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Tedesco, Lucas
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2018
País:Argentina
Institución:Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Repositorio:Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Idioma:español
OAI Identifier:tesis:tesis_n6501_Tedesco
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6501_Tedesco
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:HIF
VHL
SINDROME VON HIPPEL-LINDAU
UBIQUITINACION
RSUME
RWDD3
SUMOILACION
VEGF
VON HIPPEL-LINDAU SINDROME
UBIQUITINATION
SUMOYLATION
Descripción
Sumario:Los factores HIF son heterodímeros compuestos por dos subunidades, y β. Mientras que los niveles de HIF-β son constitutivos, la estabilidad y actividad de las subunidades HIF-1α y HIF-2α están finamente reguladas por los niveles de O2: contienen un dominio de degradación dependiente de oxígeno (ODD) que en normoxia es blanco de hidroxilación. Cuando HIF-α está hidroxilada puede interactuar con el supresor tumoral von Hippel-Lindau (VHL), que conformando un complejo proteico con Elonguina C, Elonguina B, Cullina-2 y Rbx-1 promueve la poliubiquitinación de HIF-α, señal necesaria para su posterior degradación. El sindrome de VHL es causado por mutaciones en el gen de VHL, que llevan a una inactivación total o parcial de su función y generan que la estabilidad de HIF-1α y HIF-2α sea independiente de los niveles de O2, generando una actividad constitutiva de HIF. La desregulación de las vías dependientes de HIF conduce a la aparición de tumores altamente vascularizados como producto de la desregulación de factores pro-angiogénicos como VEGF. En el sindrome de VHL estos tumores aparecen en el sistema nervioso central y retina (Hemangioblastomas), en la glándula adrenal (Feocromocitomas) y en el riñón (Carcinoma Renal de Células Claras o RCC), entre otros tejidos. Resulta de interés determinar los mecanismos involucrados que en la pérdida de función de las mutantes VHL que promueven el establecimiento de tumores dependientes de VHL-HIF. Nuestro grupo de trabajo aisló a la proteína RWDD3 o RSUME (RWD domain-containing protein SUMOylation Enhancer) que se induce en condiciones de estrés celular y participa a la modificación post-traduccional conocida como sumoilación. En particular, se demostró que RSUME se expresa en hipoxia (HPX) e incrementa la sumoilación de HIF-1α, aumentando su estabilidad y actividad transcripcional. En normoxia, RSUME aumenta los niveles de HIF-1α incluso al sobre-expresar VHL, indicando una posible inhibición funcional de RSUME sobre VHL. RSUME se expresa en los tejidos característicos del sindrome. Además, mayores niveles de ARN de RSUME en tumores RCC correlacionan con un peor pronóstico de los pacientes, indicando que RSUME podría ser un marcador a tener en cuenta en el desarrollo de la enfermedad. El objetivo de esta Tesis fue caracterizar el mecanismo molecular de acción de RSUME sobre el sistema VHL-HIF. En el contexto de la enfermedad VHL, el trabajo se centró en estudiar la función de RSUME en el establecimiento de tumores VHL analizando su rol y mecanismos de acción sobre la pérdida de función de las mutantes de VHL. En primer lugar, utilizando un modelo celular que carece de expresión de VHL (la línea celular RCC-786-O) determinamos que RSUME sólo afecta la estabilidad de HIF-1α y HIF-2α cuando VHL se expresa ectópicamente. RSUME bloquea la degradación de HIF inhibiendo la ubiquitinación de HIF dependiente de VHL. Confirmando que los efectos de RSUME son directos sobre la función de VHL, observamos que RSUME bloquea la degradación de otros blancos de ubiquitinación de VHL. Determinamos que RSUME y VHL interactúan sin intermediarios. En el contexto celular, RSUME forma un complejo con el dímero VHL-HIFα, que disminuye la interacción de VHL con HIF-1 y 2, y así, aumenta la estabilidad de estas últimas. Dado que RSUME es un potenciador de sumoilación, se determinó que RSUME modula positivamente la sumoilación de VHL tanto in vitro como in vivo. Sin embargo, observamos que RSUME bloquea la acción de VHL incluso cuando se inhibe la sumoilación general o se usa una mutante no sumoilable de VHL, indicando que la acción de RSUME es independiente de su efecto sobre la sumoilación de VHL. Luego, analizamos el impacto de RSUME sobre el establecimiento de la enfermedad VHL. Detectamos la expresión proteica de RSUME en muestras tumorales de pacientes VHL, confirmando un posible rol de RSUME en los tumores. Además, determinamos que, a diferencia de VHL salvaje, mutantes de VHL características de la enfermedad son incapaces de inhibir la expresión de RSUME sugiriendo un potencial mecanismo de desregulación de RSUME en el contexto tumoral asociado a VHL. En el estudio de los mecanismos de acción de RSUME, determinamos que la sobreexpresión de RSUME potencia la pérdida de función de las mutantes de VHL, evidenciado por una mayor estabilidad y actividad transcripcional de HIF-2α. RSUME actúa independientemente de su capacidad de sumoilar a las mutantes de VHL. RSUME se une a las diferentes variantes de VHL, promoviendo una disminución en su interacción con HIF-2α y en la formación del complejo ECV, aumentando la estabilidad de los blancos de ubiquitinación. Utilizando clones generados en un modelo celular de la enfermedad de VHL en los que silenciamos la expresión de RSUME, verificamos el rol crítico de RSUME en la perdida de función de VHL. Menores niveles de RSUME resultaron en una ganancia de función en VHL, lo que se tradujo en una disminución en la vascularización asociada a VEGF y en tumores más pequeños y menos vascularizados. En conclusión, estudiando la función de RSUME en distintos modelos experimentales y a través de estrategias experimentales complementarias, nuestros resultados evidencian el rol fundamental de RSUME en el síndrome VHL y proponen mecanismos moleculares para explicar la acción de RSUME sobre VHL, enfatizando que RSUME no sólo es un promotor de la sumoilación sino que –como en el caso de VHL- regula a otras proteínas a través de la formación de complejos proteicos que modifican su función.

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