Estudio transcripcional y post-transcripcional de la quinasa de proteínas dependiente de calcio, StCDPK1 en Solanum tuberosum y análisis de sus potenciales blancos de acción

La papa, Solanum tuberosum L., es el tercer cultivo alimenticio luego del arroz y del trigo (FAOSTAT, 2009). En el proceso de tuberización, un tallo subterráneo especializado, el estolón, sediferencia en un órgano de reserva, el tubérculo. Con el fin de comprender los mecanismos quesubyacen a este p...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Santin, Franco
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2015
País:Argentina
Institución:Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Repositorio:Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Idioma:español
OAI Identifier:tesis:tesis_n5755_Santin
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5755_Santin
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:STCDPK1
FOSFORILACION DEPENDIENTE DE CALCIO
REGULACION TRANSCRIPCIONAL
REGULACION POSTRANCRIPCIONAL POR MICRO ARNS
TUBERIZACION
CALCIUM DEPENDENT PHOSPHORYLATION
TRANSCRIPTIONAL REGULATION
POSTRANSCRIPTIONAL REGULATION BY MI RNAS
TUBERIZATION
Descripción
Sumario:La papa, Solanum tuberosum L., es el tercer cultivo alimenticio luego del arroz y del trigo (FAOSTAT, 2009). En el proceso de tuberización, un tallo subterráneo especializado, el estolón, sediferencia en un órgano de reserva, el tubérculo. Con el fin de comprender los mecanismos quesubyacen a este proceso de desarrollo y para mejorar la calidad y el rendimiento del cultivo se hanrealizado numerosas investigaciones. Entre los diversos factores que regulan la tuberización, loscambios en los niveles intracelulares de calcio y en el estado de fosforilación de las proteínas soneventos primarios que coordinan en tiempo y forma la respuesta de la planta. El calcio es unsegundo mensajero esencial en plantas y las quinasas de proteínas dependientes de calcio, CDPKs,son sensores/transductores del catión que se inducen/activan en respuesta a estímulos bióticos yabióticos (Boudsocq & Sheen 2013). Estas enzimas monoméricas poseen un dominio quinasa deproteínas (DK) unido a través de una región bisagra o dominio autoinhibitorio (DAI) a un dominioregulador homólogo a la calmodulina (CLD) con 4 sitios de unión al calcio (EF-hands). Componenfamilias multigénicas compuestas por aproximadamente 30 miembros que presentan granhomología de secuencia entre sí a excepción del dominio amino terminal variable (NTV) queregula la localización subcelular de la enzima. En Solanum tuberosum, nuestro grupo identificó tresisoformas de CDPK, StCDPK1, 2 y 3, que se expresan durante el proceso de tuberización (Gargantini et al. 2009; Giammaria et al. 2011; Grandellis et al. 2012; Raices et al. 2001; Raices etal. 2003a; Raices et al. 2003b; Raices et al. 2003c). Con el fin de estudiar la regulación transcripcional de la isoforma StCDPK1 durante el ciclo de vidade la planta de papa, se clonó y analizó su secuencia promotora, se obtuvieron y caracterizaronplantas transgénicas de papa que expresan el gen reportero β-glucuronidasa (GUS) bajo dichopromotor (plantas StCDPK1pro::GUS) y se realizaron ensayos de qRT-PCR en diferentes tejidos dela planta y estadios de tuberización. Se comparó la actividad GUS observada en las plantas StCDPK1pro::GUS con la observada en plantas CDPK3pro::GUS desarrolladas previamente (Grandellis et al. 2012) y con la de plantas CDPK2pro::GUS obtenidas también durante eltranscurso de esta tesis. Los ensayos histoquímicos indican que la isoforma StCDPK1 estáfuertemente asociada al sistema vascular de la planta y confirman que presenta una expresiónespacio temporal definida durante el proceso de tuberización. Asimismo se analizó si la expresión de StCDPK1 podía ser regulada post transcripcionalmente pormicroARNs. A través de los programas online psRNATarget y TargetAlign se identificó el miR390que tendría como blanco el transcripto de StCDPK1 provocando el clivaje del ARNm ointerrumpiendo su traducción. Los perfiles de expresión opuestos del miR390 y de StCDPK1 enestadíos de tuberización indicaron que este miARN podría regular la expresión de StCDPK1. Posteriormente, en ensayos de co-agroinfiltración en Nicotiana benthamiana se determinó que lostranscriptos de StCDPK1 son blanco de acción del miR390, demostrando, por primera vez, que una CDPK es regulada a este nivel (manuscrito enviado a Plant Mol. Biol). Además se obtuvo la proteína recombinante StCDPK1 etiquetada con 6xHis para proceder a sucaracterización bioquímica y determinar sus parámetros cinéticos. Se demostró que la proteína 6xHis-StCDPK1 es una quinasa activa dependiente de calcio, capaz de autofosforilarse en presenciadel catión y que fosforila diversos sustratos, entre los cuales se encuentra AtDi19, un factor detranscripción involucrado en la respuesta a estrés salino y sequía en Arabidopsis thaliana. Recientemente obtuvimos las proteínas recombinantes del homólogo de AtDi19 en papa y otrasdos proteínas que han sido implicadas en la inducción de la tuberización, la proteína StSP6A,homólogo en papa de flowering locus T (FT) y StPIN4, un transportador de auxinas. Próximamentese ensayará la capacidad de la enzima de fosforilar in vitro a estos sustratos. Finalmente, seprodujeron plantas que sobrexpresan la proteína StCDPK1 como una primera aproximaciónfuncional para determinar si esta isoforma interviene en la respuesta de la planta a estresesabióticos.

Similares en LA Referencia