Participación de la SUMOilación de proteínas componentes del spliceosoma en el proceso de splicing

La mayoría de los genes eucariotas por la ARN polimerasa II dan lugar a ARNmensajeros “inmaduros” o precursores (pre-ARNm) que contienen exones e intrones. Elsplicing es el proceso mediante el cual los intrones son escindidos de sus exonesflanqueantes y los exones son posteriormente religados para d...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Pozzi, María Berta
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2017
País:Argentina
Institución:Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Repositorio:Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Idioma:español
OAI Identifier:tesis:tesis_n6164_Pozzi
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6164_Pozzi
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:SPLICEOSOMA
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
SUMO
SRSF1
PRP3
SPLICEOSOME
POSTTRANSLATIONAL MODIFICATIONS
Descripción
Sumario:La mayoría de los genes eucariotas por la ARN polimerasa II dan lugar a ARNmensajeros “inmaduros” o precursores (pre-ARNm) que contienen exones e intrones. Elsplicing es el proceso mediante el cual los intrones son escindidos de sus exonesflanqueantes y los exones son posteriormente religados para dar lugar a ARN mensajerosmaduros (ARNm). Este proceso es llevado a cabo por el spliceosoma, un mega complejoribonucleoproteico compuesto por cinco partículas denominadas “snRNPs” (U1, U2, U4, U5y U6) y factores proteicos asociados. Cada snRNP está formado por un ARN pequeño nuclear (snRNA), un set común de proteínas Sm o LSm y un número variable de proteínas específicasde cada partícula. El spliceosoma no existe formado como tal en el núcleo celular sino que seensambla de novo a partir de sus componentes, de manera precisa y ordenada, sobre cadaregión del pre-ARNm que debe ser escindida reconociendo secuencias específicas quedeterminan los sitios de splicing. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron queel factor de splicing SRSF1 es también un regulador de la vía de SUMOilación, ejerciendo unaactividad de tipo E3 ligasa. Estos resultados nos condujeron a explorar una posible conexiónentre las maquinarias de SUMO y splicing, hipotetizando que la conjugación a SUMO podríamodular la dinámica del proceso de splicing al afectar las interacciones entre proteínas yentre éstas y el ARN. En este trabajo, hemos hallado que el agregado de la proteasa de SUMO SENP1 disminuye laeficiencia de splicing in vitro. Por otra parte, el análisis por espectrometría de masa deproteínas inmunoprecipitadas con un anticuerpo anti-SUMO a partir de complejosspliceosomales purificados a distintos tiempos de la reacción de splicing nos permitióidentificar diversas proteínas componentes del spliceosoma como sustratos de SUMOilación. Enfocándonos en una de ellas, la proteína componente del di-snRNP U4/U6 Prp3,detectamos su SUMOilación en células en cultivo y, mediante mutagénesis dirigida, hallamosque las lisinas 289 y 559 son sitios de conjugación de SUMO dentro de esta proteína. Observamos que la doble mutante Prp3 K289/559R, deficiente en SUMOilación, nointeracciona con los snRNAs U2 y U5 ni con las proteínas spliceosomales SF3a1 (componentedel snRNP U2) y Snu 114 (componente del U5 snRNP) a diferencia de la versión salvaje de Prp3, pero sí interacciona con proteínas y snRNAs componentes del di-snRNP. Estosresultados sugieren que el ensamblado de esta partícula (U4/U6) es independientemente dela conjugación de SUMO a Prp3 pero que sin embargo, esta modificación post-traduccionales necesaria para la interacción de Prp3 con las partículas snRNPs de las que ella no formaparte (U2, U5). Además, la versión mutante de Prp3 no logra rescatar los niveles deeficiencia de splicing de pre-ARN mensajeros cuando es sobre-expresada en células encultivo, en comparación a la versión salvaje (wild type), en un contexto de silenciamiento dela proteína endógena. Experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina sugieren queesto responde a un menor reclutamiento de la versión mutante a regiones intrónicas en el ADN, comparada con la versión salvaje, durante el splicing co-transcripcional. Estos hallazgosproponen que la conjugación de SUMO juega un papel importante en el proceso de splicingy sugieren que la SUMOilación de Prp3 participa en la formación o reclutamiento del trisnRNPdurante el ensamblado del spliceosoma.

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